酶法制備桃葉珊瑚苷元及其穩定性研究

曹金騰， 吳 濤， 董玉蓉， 仇 聰， 姜 艷， 趙林果*

(1.南京林業大學 南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037)

杜仲是杜仲科杜仲屬植物，有較高的藥用價值和經濟價值[1]，含有效活性成分達200余種，主要包括黃酮類、環烯醚萜類、多酚類、苯丙素類、多糖類等[2]。桃葉珊瑚苷是杜仲籽中主要的環烯醚萜苷類成分，具有舒張血管[3]、護肝解毒[4]、抗氧化[5]、抗骨質疏松[6]、延緩光老化[7]等多種藥理活性，但其口服生物利用度低(19.3%)[8]，難以被腸道吸收，需水解為桃葉珊瑚苷元來發揮療效。另一方面，桃葉珊瑚苷元的生理活性比桃葉珊瑚苷高很多[9]。因此，體外將桃葉珊瑚苷制備為桃葉珊瑚苷元，將大大提高桃葉珊瑚苷的生物利用度、藥理活性及其附加價值。目前，桃葉珊瑚苷元的制備方法有酸水解法和酶水解法，其中酶水解法具有反應條件溫和、專一性強等優勢。但是酶水解法存在兩方面問題，一是酶催化效率不高、酶學性質不適合催化體系的環境[9]；二是桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元穩定性差，特別是桃葉珊瑚苷元含有閉環環戊二烯吡喃型半縮醛結構，極易發生氧化聚合反應，因此，難以大量制備純度較高的桃葉珊瑚苷元[10]。國內外的相關研究表明，酶的催化轉化反應可以在水相中進行，也可以在非水相催化體系中進行[11]，采用有機溶劑-水雙相體系反應可以減少副反應的進行，提高苷元產率。Yu等[12]在雙相體系中制備薯蕷皂苷元，苷元產率大幅提高；沈玉萍[13]采用雙相酸水解法制備槲皮素，產率比傳統方法提高了39%。所以，采用有機溶劑-水雙相體系有望能提高酶的催化效率、改善桃葉珊瑚苷元在酶解及分離過程中的穩定性。在桃葉珊瑚苷元穩定性方面，盡管國內外對桃葉珊瑚苷穩定性影響因素及如何提高其穩定性做了一些研究[14-15]，但效果都不太理想，而且對苷元穩定性分析還不夠深入。本課題組自主研發了一種β-葡萄糖苷酶[16]，能有效水解桃葉珊瑚苷獲得苷元。在此基礎上，本研究優化了單水相和正丁醇-水雙相的酶解條件，分析了溫度、pH值、抗氧化劑VC濃度和有機溶劑種類等因素對桃葉珊瑚苷元穩定性的影響，以期為后續桃葉珊瑚苷元高效制備、保藏和利用提供技術支撐。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

桃葉珊瑚苷，江蘇永健醫藥科技公司；桃葉珊瑚苷元，成都普瑞法科技開發有限公司；4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(pNPG)，Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨，阿拉丁公司；D-生物素(D-Biotin)，生工生物工程股份有限公司；抗生素Zeocin、無氨基酵母氮源，南京天為公司。甲醇，色譜級；其他試劑均為國產分析純。β-葡萄糖苷酶由重組畢赤酵母菌pPICZαA-bgl1高效表達獲得；基因來源于黑曲霉Aspergillussp.NL-1；重組酶為南京林業大學微生物技術研究室研發，酶制劑制備及酶活力測定參照文獻[16]。酶活力單位(U)定義：在酶的最適溫度和pH下反應，每分鐘水解相應底物pNPG釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

ZHWY-10X水浴搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；酶標儀spectraMax190，美國分子儀器公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 單水相酶解桃葉珊瑚苷條件的優化

精確吸取桃葉珊瑚苷溶液20 μL(50 mmol/L)、一定量的β-葡萄糖苷酶酶液和檸檬酸緩沖溶液(pH值4.5，500 mmol/L)總體積共200 μL，置于離心管中，在設定溫度下水浴酶解一定時間，分別考察酶用量、酶解時間和反應溫度對單水相酶解桃葉珊瑚苷的影響。反應結束后，將酶解液置于冰上，向其中加入400 μL的甲醇溶液渦旋混勻終止酶解反應，混合溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液進行HPLC分析并計算桃葉珊瑚苷元產率。

1.3 雙相體系酶解桃葉珊瑚苷條件的優化

分別吸取1 mL桃葉珊瑚苷溶液(50 mmol/L)與酶液(25 U/mL)的混合溶液置于5 mL離心管中，取樣，經HPLC測定初始濃度；加入1 mL不同體積分數的有機溶劑置于搖床設定溫度下250 r/min振蕩酶解一定時間后，分別考察有機溶劑種類及其體積分數、反應時間、反應溫度對雙相酶解桃葉珊瑚苷的影響。反應結束后，將反應體系置于冰上，分離有機相和水相，用HPLC測定有機相和水相中桃葉珊瑚苷及苷元濃度，并計算分配系數lgP。

1.4 桃葉珊瑚苷元穩定性分析

1.4.1溫度的影響 酶解反應完立刻將酶解液置于-20～90 ℃放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.2溶液pH值的影響 酶解反應完立刻將酶解液用檸檬酸和磷酸氫二鈉調節溶液pH值為3.0～8.0，室溫放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.3抗氧化劑濃度的影響 酶解反應完立刻向酶解液分別加入2、 5、 10和20 g/L的VC水溶液，室溫放置，于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，HPLC測定桃葉珊瑚苷元殘余量，計算苷元保留率。

1.4.4有機溶劑的影響 取配制好的50 mmol/L桃葉珊瑚苷溶液，與檸檬酸緩沖溶液(pH值4.5)混勻，加入相同體積的正丁醇、正己醇和乙酸乙酯有機溶劑，構成雙相體系，分別加入相同量的糖苷酶(25 U/mL)，于35 ℃振蕩20 min，離心分離有機相，室溫放置，分別于0、 2、 4、 8、 12和24 h取樣，進行HPLC分析并計算桃葉珊瑚苷元保留率。

1.5 數據分析

1.5.1HPLC分析 采用高效液相色譜法測定桃葉珊瑚苷及其苷元的量。以桃葉珊瑚苷和苷元為標準品，以水為溶劑配制質量濃度為50、 25、 12.5、 6.25和3.125 mmol/L的標準溶液并建立標準曲線。桃葉珊瑚苷的標準曲線方程為：y=1 772.7x+170.14，R2=0.999 6。桃葉珊瑚苷元的標準曲線方程為：y=2 307.7x-62.036，R2=0.999 8。

HPLC條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；二極管陣列檢測器(DAD)，紫外檢測波長206 nm；流動相為甲醇/水(體積比10 ∶90)。

1.5.2產率計算 分配系數(lgP)按照式(1)計算，單水相桃葉珊瑚苷轉化率(ηau1)按式(2)計算，桃葉珊瑚苷元產率(Yaug1)按式(3)計算，雙相桃葉珊瑚苷轉化率(ηau2)按式(4)計算，桃葉珊瑚苷元的產率(Yaug2)按式(5)計算。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：Co—桃葉珊瑚苷或苷元在有機相中的濃度，mmol/L；Cw—桃葉珊瑚苷或苷元在水相中的濃度，mmol/L；Vw—水相的體積，L；Vo—有機相的體積，L；Cauw—水相中桃葉珊瑚苷的初始濃度，mmol/L；Cauw1—反應后水相中桃葉珊瑚苷的濃度，mmol/L；Cauo—有機相中桃葉珊瑚苷的初始濃度，mmol/L；Cauo1—反應后有機相中桃葉珊瑚苷的濃度，mmol/L；Caugw—水相中桃葉珊瑚苷元的濃度，mmol/L；Caugo—有機相中桃葉珊瑚苷元的濃度，mmol/L。

2 結果與討論

2.1 單相酶解條件的優化

2.1.1酶用量 綜合考慮酶的最適反應溫度、最適反應pH值，設定反應溫度為37 ℃，緩沖液pH值為4.5，酶解時間30 min，考察酶用量對桃葉珊瑚苷元產率的影響，結果如圖1(a)所示。隨著酶用量的增加，苷元的產率也在增加，當酶用量大于10 U/mL時，苷元產率的增加趨于平穩；當酶用量為25 U/mL時，苷元產率達到最大值。因此，為了獲得更高產率的桃葉珊瑚苷元，確定適宜酶用量為25 U/mL。

2.1.2酶解時間 設定反應溫度為37 ℃，緩沖液pH值為4.5，酶用量25 U/mL，考察酶解時間對桃葉珊瑚苷元產率的影響，結果如圖1(b)所示。酶解時間在10 min以內時，桃葉珊瑚苷元產率隨著時間的延長而快速增加；10～20 min時，苷元的產率增長緩慢，且在20 min時達到最大值，當酶解時間超過20 min時，苷元產率下降，表示桃葉珊瑚苷元確實存在進一步分解。因此桃葉珊瑚苷適宜酶解時間是20 min。

2.1.3反應溫度 設定緩沖液pH值為4.5，酶用量25 U/mL，酶解時間為20 min，考察反應溫度對桃葉珊瑚苷元產率的影響，結果如圖1(c)所示。當反應溫度小于35 ℃時，隨著溫度升高產物產率也在上升；反應溫度大于35 ℃時苷元產率隨著溫度增高而降低，因采用的β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃，表明溫度大于35 ℃時苷元降解速度大于產物積累速度，因此適宜反應溫度選擇35 ℃。在此條件下，單水相酶解制備桃葉珊瑚苷元的產率達到最高，為46.3%。

a.酶用量enzyme dosage； b.酶解時間enzymolysis time； c.反應溫度reaction temperature

2.2 雙相酶解條件的優化

2.2.1有機溶劑的篩選 在水-有機溶劑兩相體系中，有機溶劑的種類及體積分數不僅對催化反應有顯著的影響，還影響到桃葉珊瑚苷和苷元的溶解性，以及產物分離難易程度。因此實驗考察了桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在不同有機溶劑和水雙相中的分配情況，分配效果通過lgP值評價，lgP值越大說明該物質在有機相中的分布比例越高。lgP值是桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在有機相與水相中濃度的比值再取對數，lgP=0表明水相中分布比例與有機相中相同，lgP>0表明水相中分布比例小于有機相中，lgP<0表明水相分布比例大于有機相分布比例。從表1中可知，產物桃葉珊瑚苷元在多種雙相體系中lgP值均小于0，表明其在水相中的分布比例大于其在有機相中的分布比例。其中，桃葉珊瑚苷元在正丁醇中lgP值最高，表明桃葉珊瑚苷元在正丁醇中溶解性最好，最有利于苷元的穩定[9]。從底物桃葉珊瑚苷的lgP值可知，桃葉珊瑚苷在乙酸乙酯中溶解性能最好，由于酶解反應主要在水相中進行，因此乙酸乙酯-水雙相體系不利于酶解反應的進行，但桃葉珊瑚苷在正丁醇-水雙相體系中具有比較適中的分配比例。所以選用正丁醇開展后續雙相酶解制備桃葉珊瑚苷元反應。

表1 桃葉珊瑚苷和桃葉珊瑚苷元在不同有機溶劑的分配情況

2.2.2正丁醇體積分數 雙相酶解體系中體積分數為0、 20%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和90%的正丁醇對桃葉珊瑚苷轉化率和苷元產率的影響如圖2(a)所示。正丁醇體積分數小于80%時，桃葉珊瑚苷元產率隨著有機相含量的增加而提高，轉化率不斷下降。體積分數大于80%時，隨著有機相比例增加，產率逐漸下降，推測是有機溶劑抑制了酶的活性。因此選擇體積分數80%的正丁醇用于后續雙相酶解。

2.2.3反應溫度 雙相酶解體系中反應溫度對桃葉珊瑚苷轉化率和苷元產率的影響如圖2(b)所示。隨著溫度的升高，桃葉珊瑚苷的轉化率不斷提高。相同酶解時間時，桃葉珊瑚苷元在35 ℃產率最高，溫度高于35 ℃后桃葉珊瑚苷元的產率開始下降。主要原因可能是生成的苷元的量低于因溫度上升降解的苷元的量。因此，選擇雙相酶解反應溫度為35 ℃。

2.2.4酶解時間 雙相酶解體系中酶解時間對桃葉珊瑚苷轉化率和苷元產率的影響如圖2(c)所示。30 min以內，轉化率隨著時間增加而不斷升高；桃葉珊瑚苷在30 min時幾乎完全轉化，30 min以后隨著酶解時間的延長，轉化率趨于穩定，60 min時能達到完全轉化。0～20 min，桃葉珊瑚苷元產率隨著時間增加而提高，在20 min時產率達到最大值。因此，選擇雙相酶解時間為20 min。在此條件下，雙相酶解制備桃葉珊瑚苷元的產率高達87.9%。

a.正丁醇體積分數 volume fraction of n-butanol； b.反應溫度reaction temperature； c.酶解時間enzymolysis time

本研究結果表明，采用雙相水解工藝更有利于桃葉珊瑚苷元的穩定，同時能有效提高桃葉珊瑚苷元的產率。由于桃葉珊瑚苷是一種環烯醚萜苷類化合物，在水解過程中會生成半縮醛結構的苷元，苷元在水溶液中會發生自身聚合，生成二聚體，并且苷元易與具有蛋白結構的酶發生反應，伴隨褐色副產物的生成。副反應一方面鈍化了酶的活力[17]，使環烯醚萜苷的水解難以徹底完成，同時消耗了水解產物環烯醚萜苷元，降低了產率。本研究利用水解產物桃葉珊瑚苷元與桃葉珊瑚苷在有機溶劑中溶解性的差異，選用了較為合適的有機溶劑正丁醇，在酶解反應的同時，從反應液中及時萃取分離出酶解生成的苷元，減少酶的鈍化和產物的聚合，因而能顯著提高苷元的產率。

2.3 桃葉珊瑚苷元穩定性分析

2.3.1溫度的影響 在不同溫度下測定桃葉珊瑚苷元含量的變化，結果如圖3(a)所示。桃葉珊瑚苷元在-20和0 ℃條件下非常穩定，-20 ℃保溫12 h內不會降解。37 ℃保溫12 h時幾乎全部降解，隨著溫度增高苷元穩定性降低，70 ℃下保溫僅4 h苷元就幾乎全部降解，表明桃葉珊瑚苷元熱穩定性很差。

2.3.2pH值的影響 在不同pH值條件下分析桃葉珊瑚苷元含量，結果如圖3(b)所示。桃葉珊瑚苷元在酸性條件下較為穩定，在中性和堿性條件下極易分解，在pH值3.0條件下8 h僅降解12%。

2.3.3抗氧化劑質量濃度的影響 桃葉珊瑚苷元極易發生氧化聚合反應，通過添加抗氧化劑如VC溶液可以一定程度緩解桃葉珊瑚苷元的降解。在不同VC質量濃度下測定桃葉珊瑚苷元含量，結果如圖3(c)所示。桃葉珊瑚苷元在抗氧化劑存在條件下相對穩定，VC加入后苷元分解量明顯減少，隨著加入VC質量濃度的增加，苷元分解持續減少，VC質量濃度高于5 g/L時，苷元分解量不再持續減少，因此最適VC質量濃度為5 g/L，此時桃葉珊瑚苷元2 h內僅降解8%。

2.3.4有機溶劑的影響 苷元在有機溶劑正丁醇、正己醇中溶解性較好，且桃葉珊瑚苷元在低溫的乙酸乙酯中比較穩定[9]，因此考察了3種有機溶劑對桃葉珊瑚苷元穩定性的影響，結果如圖3(d)所示。以苷元在水相溶液中穩定性作為對照，可以看出桃葉珊瑚苷元在正己醇中穩定性較差，4 h內完全降解；在乙酸乙酯和正丁醇中比較穩定，8 h內幾乎不降解。但乙酸乙酯-水體系易發生乳化現象，影響苷元的分離。

a.溫度temperature； b.pH值 pH value； c.VC質量濃度 VC mass concn.； d.有機溶劑種類types of organic solvents

顯然，有機溶劑對桃葉珊瑚苷元穩定性有較大影響，可能是由于有機溶劑對桃葉珊瑚苷元產生了溶劑化效應[18]。溶劑化效應可以提高異構體的穩定性，極性較大時穩定性顯著增強，因此桃葉珊瑚苷元在極性較高的正丁醇中穩定性顯著增強。研究結果也表明，在今后制備桃葉珊瑚苷元的整個過程中，要將酶法轉化影響因素、分離方法、保藏手段與桃葉珊瑚苷元穩定性影響因素結合起來。

3 結 論

3.1適宜的單水相酶解桃葉珊瑚苷條件為：酶用量25 U/mL、酶解時間20 min、反應溫度35 ℃，在此條件下，桃葉珊瑚苷元的產率為46.3%；雙相酶解法催化桃葉珊瑚苷生成桃葉珊瑚苷元的適宜條件為：正丁醇體積分數為80%、酶用量25 U/mL、酶解時間20 min、反應溫度35 ℃，在此條件下，桃葉珊瑚苷元的產率高達87.9%，是目前有關報道中最高的產率。而且雙相酶解法能在反應的同時萃取分離生成的苷元，將其保留在有機相中，減少酶的鈍化和產物的聚合。

3.2桃葉珊瑚苷元熱穩定性較差，在-20和0 ℃條件下非常穩定；在pH值3.0時較為穩定，8 h內僅降解12%；苷元極易氧化聚合，添加5 g/L的VC可在一定程度緩解桃葉珊瑚苷元的氧化聚合；有機溶劑極性影響著桃葉珊瑚苷元的穩定性，桃葉珊瑚苷元在正丁醇和乙酸乙酯中都比較穩定，但由于乙酸乙酯相與水相極易產生乳化，正丁醇更利于分離、保存桃葉珊瑚苷元。