應用流式細胞術檢測急性髓系白血病微小殘留病的臨床研究

艾克拜爾·阿布都熱衣木，阿孜古麗·麥麥提，阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼，帕提古力·蘇力坦，徐麗，吾拉木江·艾力 ，巴哈古麗·玉素甫

（1.喀什地區第一人民醫院，新疆 喀什；2.喀什地區結核病防治所，新疆 喀什）

0 引言

急性髓系白血?。ˋcute Myeloid Leukemia, AML）是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，各亞型有不同的形態學、免疫表型、細胞遺傳學和分子生物學特征。目前化療后完全緩解率（Complete Remission, CR）可達60%～80%，大部分成人AML患者在通過誘導緩解化療獲得形態學上確定的完全緩解（CR）后復發[1-2]。這說明目前的化療方案還不能完全清除體內的白血病細胞，而這些化療后殘留的白血病 細 胞，即 微 小 殘 留 ?。∕inimal Residual Disease, MRD），就是復發的根源[3-4]。來自歐洲白血病網絡MRD工作組的共識文件[5]將微小殘留病稱為可測量的殘留?。∕easurable Residual Disease, MRD），認為它是急性髓系白血?。ˋML）的一個獨立的、診斷后的預后指標，它與初診時評估用的其它成熟的臨床、細胞遺傳學和分子生物學數據相結合，對風險分層和治療計劃非常重要。該工作組建議流式細胞術檢測非常低水平的MRD（小于10-4）可以作為區分預后特別好的分界值，即免疫學水平緩解的標準。本研究選用AML各亞型白血病相關免疫表型中平均表達率較高的CD抗原構成一個特異性組合來檢測急性髓系白血病MRD，試圖研究應用流式細胞術檢測急性髓系白血?。ˋML）微小殘留?。∕RD）的有效方案及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例

收集2018年1月至2020年6月在新疆喀什地區第一人民醫院血液內科住院治療的初診AML患者共53例，其中男29例，女24例。年齡14～70歲，平均年齡34歲。M1為2例（3.8%），M2為31例（58.8%），M3為13例（24.5%），M4為5例（9.4%），M5為2例（3.8%）。

1.1.2 對照組

我們收集20例非再障良性貧血患者作為對照，其中男11名，女9名，平均年齡41歲，骨髓抗原平均表達率0.007%。

1.1.3 診斷及療效標準

本研究收集的53例AML患者均參照2016年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類MICM分型標準[6]確診。對于復發難治組的診斷標準參照復發難治性急性髓系白血病中國診療指南（2017年版）[7]。

1.1.4 治療方案

本研究化療方案參照成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜毎籽。┲袊\療指南（2017年版）[8]和中國急性早幼粒細胞白血病診療指南（2014年版）制定[9]。

1.2 研究方法

1.2.1 流式細胞術

應用流式細胞術檢測免疫表型和微小殘留病，我院 引 進 的 流 式 細 胞 儀（Flow Cytometer，FCM）是 國 產MINDREY? BriCyte? 流式細胞儀，單克隆抗體由美國BD公司提供，本研究所選的CD抗體包括：CD7、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD56、CD64、CD117、MPO和 HLA-DR共12種，涵蓋了AML各亞型平均表達率較高的特異性免疫標志。CD抗原表達陽性的判斷標準：髓細胞膜抗原熒光陽性細胞＞20%，胞漿抗原和CD34、CD38則熒光陽性細胞＞10%[10-11]。

1.2.2 細胞形態學檢查

骨髓涂片及血涂片用瑞氏染色分類計數，同時做細胞化學染色，包括過氧化物酶染色（POX）、非特異性酯酶+氟化鈉抑制實驗（NSE+NaF）、中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）和糖原染色（PAS）。

1.2.3 統計學方法

研 究 資 料 用SPSS17.0（Statistical Package for Social Sciences）社會科學統計軟件包進行統計處理，計量資料用率描述，用雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。所有研究資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗（f檢驗），如果方差齊用t檢驗，如果方差不齊用t'檢驗。

2 結果

2.1 初診時免疫表型特點

初診時用流式細胞術檢測53例AML抗原平均表達率23.97%，各亞型抗原平均表達率M1為14.6%，M2為24.2%，M3為23.3%，M4為30.9%，M5為17.1%。

2.2 誘導緩解化療結束時免疫表型特點

53例AML患者誘導緩解化療結束時根據骨髓細胞形態學分緩解（CR）組和未緩解（NR）組，CR組37例，NR組16例，緩解率69.81%。CR組抗原平均表達率12.84%，NR組抗原平均表達率20.71%。

2.3 持續化療時免疫表型特點

53例AML在鞏固化療過程中4例行異基因造血干細胞移植，7例放棄治療，未能繼續隨訪。堅持鞏固化療的42例AML在化療第6個月時根據骨髓細胞形態學分持續緩解（CCR）組和復發難治（RR）組，CCR組29例，RR組13例，持續緩解率69.1%。CCR組抗原平均表達率4.427%，RR緩解組抗原平均表達率16.32%。繼續鞏固化療第12月時形態學持續緩解狀態的29例AML根據流式細胞術檢測MRD低于10-4為標準分免疫學緩解（ICR）組和非免疫學緩解（NICR）組，ICR組17例，NICR組12例，免疫學緩解率58.6%。ICR組抗原平均表達率0.009%，NICR組抗原平均表達率0.415%。

2.4 緩解組、未緩解組與對照組比較

研究發現：（1）緩解組與對照組比較，P＜0.05，有統計學意義，緩解組MRD陽性；（2）未緩解組與對照組比較，P＜0.05，有統計學意義，未緩解組MRD陽性；（3）緩解組與未緩解組比較，P＜0.05，有統計學意義，未緩解組MRD水平高于緩解組（請見表1）。

2.5 持續緩解組、復發難治組與對照組比較

研究發現：（1）持續緩解組與對照組比較，P＜0.05，有統計學意義，持續緩解組MRD陽性；（2）復發難治組與對照組比較，P＜0.05，有統計學意義，復發難治組MRD陽性；（3）持續緩解組與復發難治組比較，P＜0.05，有統計學意義，復發難治組MRD水平高于持續緩解組（請見表1）。

2.6 免疫學緩解組、非免疫學緩解組與對照組比較

研究發現：（1）免疫學緩解組與對照組比較，P＞0.05，無統計學意義，免疫學緩解組MRD陰性；（2）非免疫學緩解組與對照組比較，P＜0.05，有統計學意義，非免疫學緩解組MRD陽性；（3）免疫學緩解組與非免疫學緩解組比較，P＜0.05，有統計學意義，非免疫學緩解組MRD水平高于免疫學緩解組（請見表1）。

表1 各組抗原平均表達率比較（n, %）

3 討論

AML是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，各亞型有不同的形態學、免疫表型、細胞遺傳學和分子生物學特征。AML免疫表型所表達的抗原具有很大的異質性，這種異常表達的抗原不僅在初診時AML中檢測到，在形態學完全緩解后的骨髓和外周血中也可以檢測，甚至在復發時仍可以檢測到。臨床MRD的檢測一般都是利用白血病細胞的這種克隆性增生的特征為依據。近十年來國內外對急性白血病MRD的檢測有很多的研究，目前急性淋巴細胞白血病MRD的檢測已經比較規范，但是急性髓系白血病MRD的檢測還不夠規范，原因在于AML亞型多，免疫表型復雜，找到有效檢測白血病相關免疫表型（Leukemia Associated Immunophenotypes, LAIPs）特異性CD抗原組合比較困難。Elaine CS等[12]應用22個CD標記物研究AML微小殘留病。本研究選用急性髓系白血病各亞型白血病相關免疫表型中平均表達率較高的12個CD抗原構成一個特異性組合，即CD7、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD56、CD64、CD117、MPO和HLA-DR，利用它們相應的單克隆抗體，應用流式細胞術對AML各亞型的MRD進行動態檢測。我們發現通過這種組合檢測53例AML患者免疫表型初診時抗原平均表達率23.97%，誘導緩解化療結束時緩解組12.84%、未緩解組20.71%；繼續鞏固化療第6月時持續緩解組4.427%、復發難治組16.32%，化療第12月時免疫學緩解組0.009%、非免疫學緩解組0.415%?？梢婋S著化療的持續進行AML抗原平均表達率有逐漸降低的趨勢，這種趨勢通過流式細胞術散點圖分析可以很好的描述。我們經過統計分析發現：（1）繼續鞏固化療第6月時持續緩解組抗原平均表達率（4.427%）與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），說明鞏固化療后處于細胞形態學持續緩解狀態的AML中仍能檢測出較高水平的MRD，該組患者尚未達到免疫學水平的緩解。（2）繼續化療第12月時免疫學緩解組抗原平均表達率（0.009%）與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），說明這組患者中未能檢測出MRD，可以說該組患者達到比形態學更深層次的緩解，即免疫學水平的緩解。

目前研究認為AML鞏固化療后MRD水平＞10-2，為高危組，復發率80%以上；MRD水平在10-3～10-2，為中危組，復發率40%以上；MRD水平在10-4～10-3，為低危組，復發率10%以上；MRD水平＜10-4，為極低危組，復發率5%以下。在我們研究中發現化療第6月時持續緩解組抗原平均表達率8.625%，即8.625×10-2，按上述分級屬高危組?；煹?2月時免疫學緩解組抗原平均表達率0.009%，即0.9×10-3，按上述分級屬極低危組，說明該組患者預后特別好，可以進入維持化療。

根據以上結論，本研究選用的一組特異性CD抗原可以對急性髓系白血病的MRD進行有效的監測，有助于提高檢測MRD的可信度并減少檢測成本，為臨床治療AML提供了可靠的參考。對本研究資料進行統計分析時我們還發現，第一次誘導緩解化療后MRD水平比較低的患者后期復發的可能性比較少。這說明第一次緩解后檢測MRD對預后有意義，但是MRD水平到底多少才會復發這個問題有待于進一步研究。多項研究提示鞏固化療后MRD水平小于10-4的患者復發可能性很小，可以進入維持化療，但是對于維持化療多長時間才能終止治療這個問題也需要進一步研究。臨床上應用流式細胞儀動態檢測AML微小殘留病有利于我們制定化療方案，使我們能夠避免MRD水平高的患者治療強度不夠，而MRD水平低的患者接受不必要的過度治療，這將顯著提高急性髓系白血病的治療水平，為達到免疫學完全緩解提供可靠的依據。