牙本質脫礦方法和藥物的體外研究進展

付玉琴，張石楠，劉波，呂長海，李曉麗，劉娟

(昆明醫科大學附屬口腔醫院a.兒童口腔科； b.口腔預防科，昆明 650106)

牙本質是牙齒的重要組成部分，也是牙齒承擔外界應力以及預防牙髓組織感染的重要結構。當齲病累及牙本質時，在細菌及其毒素產生的低pH環境下，牙本質羥基磷灰石中的鈣、磷等無機成分持續脫礦，管間牙本質和管周牙本質因脫礦而表面粗糙，牙本質小管開放[1]，細菌及其代謝產物可經開放的小管或粗糙的孔隙感染牙髓，并逐漸侵犯根部牙本質。臨床上，樹脂充填齲洞前，必須對牙本質行酸蝕粘接劑處理，以去除玷污層或改善牙本質界面的形態，以利于修復體形成良好固位；而清除根管內壁感染牙本質是根管消毒的要求之一，也是根管治療成功的保證。此外，疏通鈣化根管是臨床根管治療的常見步驟。因此，在大部分牙體疾病的發病、治療、預后中，牙本質中的礦物質均參與其中。對牙本質病理性脫礦機制的研究有助于闡述疾病病理，對癥下藥；而對各類藥物脫礦療效的研究則有助于尋找更好的治療方式。由于受臨床研究局限性的影響，大多數學者采用體外研究的方式對牙本質病理變化及藥物療效進行研究?，F對目前體外構建牙本質脫礦模型的方法及牙體疾病治療過程中脫礦藥物的研究現狀予以綜述，以期為相關臨床及科研工作提供幫助。

1 牙本質脫礦方法

齲病生成的四聯因素理論認為，齲病所致的牙體組織產生機械、理化性質改變由致齲菌、食物、宿主和時間4種因素共同作用導致。牙本質脫礦方法通過模擬牙本質齲生成的條件建立體外牙本質齲脫礦模型，包括模擬主要的牙本質齲生成因素，如致齲微生物及微生物生成的有機酸、口腔唾液環境及隨進食產生的pH值改變等，并分析各種脫礦方法與自然牙本質齲損在物理、機械、化學性質等方面的差異。

1.1微生物脫礦法 微生物脫礦法利用主要致齲菌及其代謝產物對牙本質的作用，使牙本質表面發生脫礦及膠原降解等病理改變[2]，其病理結構與自然形成的牙本質齲高度相似。通常將體外培養的1種或幾種主要致齲菌接種到樣本表面，或將樣本浸泡于菌液中，經過一段時間的恒溫換液培養后，檢測其性質的改變[3]。Marquezan等[4]認為，微生物使臨床建議保留的牙本質脫礦層轉變為軟化牙本質，使膠原降解、脫礦牙本質表層柔軟，形成類似細菌感染層的結構。脫礦牙本質的病理結構分為大量脫礦的病損體部及表面的透光區兩部分，與自然牙本質齲的不規則形態類似[5]。除無反應性牙本質生成外，微生物脫礦法模擬的牙本質齲的性狀更接近自然牙本質齲的表現。

正常牙本質的粘接性與牙本質齲脫礦層的粘接性不同。微生物的作用對粘接劑粘接性的影響尚無確切定論[5-6]。研究證實，致齲微生物在體外可短期內生成標準牙本質齲模型[7]。因此，微生物脫礦模型對于研究各類粘接劑的真實粘接效果、促進粘接劑改良具有重要意義。此外，常應用微生物脫礦法評估修復材料的療效[8]。隨著培養基中營養物質的消耗，細菌活性將發生改變，故難以長時間維持固定的pH值，常規微生物脫礦模型采用定量、定期更換培養液的方式手動調節pH值。為了更真實地模擬口內環境的牙本質齲，有學者采用計算機控制的連續微生物培養模型，以動態而精細地調控細菌生長環境，同時采用人造口腔模擬牙本質的咀嚼負荷，營造高度近似口腔生理環境的致齲環境[9]，此方法對于闡述齲病發生發展的病理機制具有重要意義，可能是未來牙本質齲及其脫礦模型的發展方向，但由于步驟繁瑣、設備昂貴、用時較長，且存在細菌污染的可能，目前并不常用。

1.2化學脫礦法 化學脫礦法利用致齲菌生成的有機酸產物在牙本質的作用研究其對羥基磷灰石的溶解脫礦作用?；瘜W脫礦法所用溶液由各種含或不含鈣、磷等物質的低pH值有機酸或有機酸鹽組成，模擬牙體脫礦時的口腔內酸性環境。

1.2.1靜態脫礦液脫礦法 致齲菌生成的產物主要為乙酸或乳酸，可溶解羥基磷灰石，使牙本質脫礦。因此，含乙酸或乳酸的脫礦液是人造牙本質化學脫礦模型的常用成分[10]。Joves等[11]通過比較乳酸脫礦液形成的牙本質齲結構與正常牙本質、自然形成牙本質齲的不同，探討乳酸脫礦液模擬人體自然脫礦的可行性及局限性，掃描電鏡結果顯示，在自然形成牙本質齲表面和乳酸脫礦牙本質表面存在結構差異，前者牙本質小管閉塞，存在較厚的表面玷污層，管間牙本質膠原纖維被礦物質晶體包裹；后者牙本質小管開放，表面玷污層較薄，管間牙本質膠原纖維暴露；進一步檢測顯示，兩種牙本質的不同深度的礦物質密度及其對粘接界面微拉伸機械強度的影響相似，證實了采用乳酸脫礦液模擬自然形成牙本質齲并研究牙本質脫礦界面粘接性能的可行性。

除乳酸脫礦作用外，自然形成牙本質齲還受到甲酸、乙酸及各類膠原酶等的作用，故相同牙本質深度的牙本質礦物質含量、顯微硬度值低于乙酸或乳酸脫礦液形成的脫礦牙本質，但在牙本質表層至其下130 μm范圍內，兩者的差異無統計學意義；隨著檢測深度的增加，乙酸作用牙本質硬度值的變化模式仍與自然脫礦牙本質類似，故認為乙酸脫礦7 d可高度模擬牙本質表層至其下130 μm內的自然牙本質齲脫礦層[11-12]。經相同pH值乙酸及乳酸脫礦液作用的正常牙本質，與14 d組相比，7 d組在最終脫礦深度更高，但兩者礦物質密度的變化模式相同[13]。牙本質脫礦深度及硬度隨作用時間延長而增加，脫礦達一定深度后逐漸與正常牙本質值接近[2,4]。但由于靜態環境中pH值的升高及作用時間有限[14]，乙酸或乳酸形成的脫礦深度均較淺。Marquezan等[4]比較更長作用時間下乙酸與乳酸的脫礦效果發現，前期乙酸脫礦速率較快，但最終脫礦深度及總脫礦量不及乳酸，可能由于乙酸擴散的動力學效果更好，因而前期擴散速度及脫礦速率較快；而乳酸對管周牙本質的礦物質溶解效果更明顯，膠原纖維暴露量更多[15]，同時具有激活牙本質中組織蛋白酶K、促進膠原降解的作用[16]，后期更有利于滲透入深層牙本質中；且乳酸解離平衡常數低于乙酸，因此脫礦潛力更大[17]。綜上所述，含乙酸和乳酸的脫礦液是進行靜態牙本質齲模擬比較理想的材料。目前已被應用于化學模擬牙本質齲，并在脫礦牙本質再礦化治療、牙本質粘接及修復的研究中具有較好的應用適應性。但短期內模擬牙本質齲脫礦淺層的研究更傾向于選擇含乙酸的脫礦液；若需獲得更高的脫礦深度，則傾向于選擇乳酸脫礦法。

1.2.2動態pH循環脫礦法 pH循環脫礦法利用不同pH值、不同礦物質組成的脫礦液、再礦化液的循環作用建立牙本質脫礦模型，以模擬人體反復進食后產生的口腔動態pH環境改變，其中脫礦液一般為酸性乙酸緩沖液，再礦化液為中性磷酸鹽緩沖溶液。與靜態模擬法不同，pH循環脫礦法在脫礦液作用間歇使用中性緩沖液，故產生相同脫礦深度的作用時間更長。Lenzi等[18]的研究發現，pH循環脫礦法作用14 d后，乳牙或恒牙牙本質表面下15～250 μm內的平均努氏顯微硬度值較相應自然脫礦牙本質低，但兩者比較差異無統計學意義，故推斷pH循環脫礦法可用于模擬乳、恒牙牙本質齲。Marquezan等[4]橫向比較10～500 μm內不同橫截面顯微硬度值發現，pH循環組脫礦牙本質顯微硬度值在牙本質表面下40 μm內的變化均與自然脫礦組相似；但其牙本質表面下40 μm以下的顯微硬度值逐漸升高，且均高于自然脫礦牙本質，因此該動態脫礦法可模擬短時間內生成的較淺牙本質脫礦層；而pH循環組與乳酸凝膠組的比較表明，pH循環法產生的脫礦層更深，與自然脫礦層顯微硬度值更加接近。目前pH循環脫礦法不僅用于再礦化治療中牙本質淺層的脫礦模擬[19]，也用于體外模擬口腔動態pH環境下各種再礦化治療藥物的抗繼發齲效果[20]及修復體微滲漏的研究[21]。

Sung等[22]研究發現，化學脫礦法、微生物培養法均能產生與自然形成牙本質齲脫礦層相似的結構改變，且余留牙體鈣/磷比值無差異，鈣、磷損失量由大到小依次為化學脫礦法、微生物培養法、自然形成牙本質齲，而微生物培養法受累范圍更廣。研究表明，脫礦方法可能對牙本質粘接或修復的研究結果產生影響[8,23]。在模擬自然脫礦牙本質齲時，根據研究目的，微生物脫礦法更適宜于模擬帶有細菌侵入層、脫礦層的牙本質齲結構，可模擬深層牙本質的脫礦。一些學者也用這種方法檢測氟預防原發齲或繼發齲的作用[24]。

2 牙本質脫礦藥物

在牙本質粘接系統、根管治療過程中，脫礦效果是評價藥物對牙本質表面玷污層的清理、改性及鈣化根管疏通療效的重要內容[25]。

2.1一元酸脫礦藥物 牙本質粘接系統中常用的磷酸酸蝕劑對牙髓神經末梢刺激較大，作用后牙本質開放程度較高，粘接劑不能有效封閉牙本質小管，導致術后牙本質敏感性較高[26]，因而近年來學者們致力于尋找既能改善牙本質粘接術后敏感性，又能提高粘接效果的方法。其中含弱酸性有機酸的自酸蝕粘接劑改良是研究的熱點。利用自酸蝕粘接劑(OptiBond All-In-One一步法粘接劑中加入乙酸成分)的酸蝕作用對牙本質進行淺層脫礦，以改善傳統自酸蝕粘接劑的粘接性能。研究表明，pH值為2的溫和自酸蝕粘接系統僅形成表層脫礦，更利于粘接[27]。而兩步法自酸蝕粘接劑的粘接強度高于一步法自酸蝕粘接劑，可有效防止微滲漏[28]。因此，自酸蝕粘接系統更適宜于牙本質粘接。

2.2二元酸脫礦藥物 二元酸脫礦藥物主要包括馬來酸、酒石酸、蘋果酸和乙二酸(即草酸)。研究發現，與乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)相比，7%馬來酸處理牙本質的鈣釋出量比較差異無統計學意義，磷、氧釋出量增加，而碳釋出量減少[29]。沈晴昳等[30]的體外研究顯示，15%酒石酸處理牙本質60 s后，牙本質小管開口明顯擴大，與傳統磷酸酸蝕15 s后的牙本質小管的直徑相當；蘋果酸作用后牙本質小管的開放程度最低。除上述二元酸外，乙二酸可通過較強的化學結合鍵黏附于羥基磷灰石，形成新的鈣鹽產物，而該鈣鹽產物不易被酸溶解，故鈣流失極少，同時，乙二酸的化學結合鍵結合強度高于乳酸、檸檬酸和馬來酸及其他有機酸，使其在降低牙本質粘接術后敏感性方面具有較好的應用優勢，是修復粘接前預處理的潛在制劑之一[31]；馬來酸、檸檬酸和乳酸與羥基磷灰石黏附后生成相應的鈣鹽沉淀，并易溶于各自的酸性溶液中，經超聲清洗后，牙本質將發生顯著脫礦[32]。上述二元酸的酸性顯著低于磷酸，對牙髓組織的刺激較弱，可用于新型牙本質粘接系統的研發，如第6代粘接系統Contax中加入馬來酸，其粘接強度與第7代粘接系統Clearfil S3相近[33]?？梢?，粘接系統的改良可以從添加二元酸脫礦藥物的成分考慮。

2.3三元酸脫礦藥物 主要的三元羧酸為檸檬酸及其混合物。Marshall等[34]認為，檸檬酸對管周牙本質和管間牙本質的脫礦作用隨時間呈線性改變；檸檬酸濃度越高，脫礦越快；但作用一段時間后，管間牙本質脫礦速率減慢，與磷酸的脫礦改變模式類似，除2 mol/L檸檬酸濃度組外，其余各組均在短時間內出現穩定的平臺期，平臺期內管間牙本質脫礦速率不隨脫礦深度的增加而改變；不同磷酸濃度對淺層或深層管周牙本質的脫礦速率無顯著影響，但pH值降低能顯著改變脫礦速率，檸檬酸脫礦速率受pH值影響的改變更加明顯。Gandolfi等[35]的研究表明，10%檸檬酸與10%EDTA 1 min的牙本質脫礦能力相同；經處理的牙本質表面的牙本質完全開放，無玷污層或牙本質碎屑，管周牙本質排列緊密而均勻；作用1 min后，羥基磷灰石與Ⅱ型氨基酸的比值降低，脫礦明顯。

基于檸檬酸鹽的脫礦作用，由檸檬酸、多西環素、去污劑組成的混合溶液——MTAD(mixture of tetracycline isomer,an acid and detergent)與抗菌藥物及去污劑同時作用能夠去除玷污層、脫礦根管壁，起到強力清理根管壁的作用。Kumar等[36]的研究表明，MTAD是具有應用潛力的根管沖洗液，并不會改變牙本質小管的結構。經檸檬酸脫礦牙本質的內部轉化生長因子易被激活，可吸引牙髓干細胞聚集、存活及修復，從而調控修復性牙本質的生成[37]。

2.4多元酸脫礦藥物

2.4.1EDTA及其混合物脫礦藥物 EDTA是常用的根管預備制劑，利用螯合作用結合牙本質中的鈣離子使之脫礦。體外研究表明，EDTA可導致根管壁牙本質超微結構及成分的改變，主要表現為鈣、磷的流失和牙本質膠原纖維的暴露；而EDTA濃度越高，牙本質中磷酸鹽流失越多，膠原暴露量越大[38]。Scelza等[39]比較17% EDTA與10%檸檬酸對30歲以下或60歲以上人群前磨牙根的脫礦作用發現，4組牙本質小管的開放數量比較差異無統計學意義；17% EDTA使60歲以上人群牙本質小管的開放直徑增大；10%檸檬酸對牙本質小管直徑的改變無年齡差異，故EDTA在老年人群鈣化根管疏通方面具有優勢。有學者認為，17% EDTA作用60～90 s能形成較好的利于粘接的預處理表層[40]。張彥[41]的研究表明，EDTA作用72 h時，牙本質中礦物質大量流失；作用168 h后，根管中上段牙本質內壁下深度550 μm內的牙本質顯微硬度顯著降低，且牙本質顯微硬度隨EDTA濃度的升高而明顯降低；余留牙本質的鈣/磷比保持不變。Schwendicke等[42]使用17%中性EDTA溶液作用于脫礦牙本質96 h后，牙本質中的礦物質迅速流失，并形成深度約700 μm的脫礦層，其脫礦程度高于乙酸及乳酸脫礦法、pH循環脫礦法、細菌培養脫礦法及自然脫礦形成的牙本質脫礦層。Ghisi等[43]的掃描電鏡結果顯示，EDTA使牙本質脫礦的同時并不破壞有機質，只有聯合使用次氯酸鈉時才會發生牙本質侵蝕和牙本質小管開放。Prasad和Donoghue[44]比較EDTA、8%和10%的硝酸、8%和10%的甲酸、Perenyi液體(硝酸和鉻酸的乙醇混合液)對大鼠下頜骨和牙的脫鈣作用發現，EDTA脫鈣時間最長，但對牙本質小管中的細胞、空泡變、磨損程度最低，幾乎可以忽略不計；而8%與10%的硝酸脫鈣最快，但與EDTA組相比，8%牙硝酸組的牙本質破壞程度降低，8%牙硝酸組的牙本質破壞程度加重；8%與10%的甲酸脫鈣速率僅次于EDTA組，且其牙本質破壞程度分別與8%、10%的硝酸相當；而Perenyi液體的牙本質破壞程度最重；故認為EDTA和8%的硝酸較易獲得符合生理學要求的脫鈣染色切片，在時間允許的條件下，EDTA是制作牙本質脫鈣染色切片的理想制劑之一。EDTA是最溫和的脫鈣預處理劑，還可作為制作病理切片的脫鈣液。另有研究認為，除1% EDTA外，經10%、17% EDTA脫礦的牙本質基質發生了膠原重排[35]，但內源性蛋白酶的活性未改變[45]，故可用于制備具有酶活性的脫礦牙本質基質。

由EDTA與氯己定、表面活性劑組成的混合液QMix也被用作根管沖洗液。比較EDTA、馬來酸、QMix的根管壁脫礦作用發現，QMix使牙本質釋放出的鈣元素多于EDTA、馬來酸，但牙本質碳元素的減少量低于EDTA[22]，可能是表面活性劑提高了QMix的滲透力，使QMix具有更強的脫礦作用；氯己定對內源性蛋白酶產生的抑制作用，使膠原溶解減少、碳元素流失降低[46]。另有研究指出，17% EDTA在根尖處的玷污層效果不如QMix與MTAD，認為EDTA對羥基磷灰石有一定的作用效果，也通過作用于牙本質中非膠原蛋白而發揮療效，而根尖處非膠原蛋白含量較少，因而去除牙本質玷污層的療效減弱；而QMix在根管上中下三段的玷污層清理效果均較好，與MTAD的作用效果類似[47]，即使聯合次氯酸鈉溶液，也不會對牙本質膠原蛋白形態產生明顯改變，脫礦的同時也并不改變牙本質的無機結構，在保持牙本質的有機和無機成分方面具有較好的特性；EDTA不改變牙本質的膠原蛋白結構，但可改變其無機結構，故QMix被認為是比EDTA更好的根管沖洗液[48]。

2.4.2含酸性基團的功能性單體脫礦藥物 自酸蝕處理劑中的功能性單體含有酸性基團，通過黏附-脫鈣作用與鈣離子結合，形成鈣-單體復合物，從而與羥基磷灰石建立非常穩定的化學結合，改性玷污層；同時促進樹脂單體滲透性，形成樹脂突進行機械固位[32]。Mai等[49]使用不同分子大小的聚丙烯酸鈉鹽處理牙本質，與10%磷酸脫礦組相比，能更好地保持脫礦牙本質的機械性能，卻未改變濕粘接或干粘接后的微拉伸機械強度。Wang等[50]的研究證實，含有磷酸甘油二甲基丙烯酸酯單體的自酸蝕粘接劑的脫礦作用最顯著，乙醇擦拭后牙本質小管呈開放狀態，并形成最長的樹脂突，即刻微拉伸機械強度最高，但難以長時間保持，遠期受熱循環作用，其而微拉伸機械強度降低，形成納米滲漏。而含有10-甲基丙烯酸氧癸基磷酸二氫酯單體組分的粘接劑形成的1 μm短樹脂突能很好地黏附于處理面，熱循環對其耐久度影響也較小。6-甲基丙烯酰氧基己基磷酸二氫鹽易被酒精去除，親水性不如10-甲基丙烯酸氧癸基磷酸二氫酯，形成的親水性單體-鈣結合物連接強度較低，遠期修復效果不佳[50]。

孫靜晴[51]通過原子力顯微鏡觀察37%磷酸、Superbond C&B兩種全酸蝕系統以及Clearfil SE Bond、iBond兩種自酸蝕系統，結果顯示，兩種全酸蝕系統的脫礦深度明顯大于兩種自酸蝕系統，其中iBond脫礦深度明顯高于Clearfil SE Bond；全酸蝕系統組幾乎無完整的管周牙本質，且膠原纖維網失水塌陷較多，而自酸蝕系統對管周牙本質的破壞相對較少，但自酸蝕粘接劑中單體的水解穩定性較差，易發生微滲漏。研究表明，聯合次氯酸鈉行有機物降解可提高自酸蝕單體的粘接強度，降低納米滲透發生率[52]。

2.5其他 除上述制劑外，某些有機提取物也具有脫礦功能，并可同時改善牙本質的粘接效果。植物提取物肌醇六磷酸具有脫礦酸蝕作用，Kong等[53]研究顯示，與EDTA、磷酸相比，粘接界面微拉伸強度高，可更好地防止膠原破壞，其納米滲透性低。殼聚糖除具有與EDTA相似的脫礦能力外[54]，還對內源性蛋白酶具有直接抑制作用，其細胞毒性作用24 h后即消失，且其內源性蛋白酶抑制作用和細胞毒性作用均與EDTA類似[55]。Gu等[56]的研究顯示，1%脫乙酰殼聚糖在溶解膠原外礦物質的同時保持了膠原內的礦物質，降低了內源性蛋白酶的膠原降解，處理60 s不會對粘接強度產生影響，故可作為粘接前預處理劑。有研究顯示，殼聚糖在根尖1/3處也能發揮較好的脫礦滲透作用，且去除玷污層的效果強于MTAD[57]。因此，含有上述配方的制劑可能是未來根管沖洗液研究的新方向。

3 小 結

牙本質脫礦方法多樣，不同牙本質脫礦藥物的作用效果也不同。目前，羥基磷灰石溶解脫礦的機制尚不明確[58]，未能完美模擬牙本質脫礦條件的復雜性，也未能實現對牙本質脫礦深度的精準調控，上述內容是未來牙本質脫礦方法改良的重點之一。除脫礦效果外，還應更加注重牙本質粘接修復及根管沖洗藥物的脫礦界面雜化層機械強度、老化及其對充填材料微滲漏或留存率等方面的影響。研發兼具淺層脫礦與抑制膠原降解或促進脫礦界面未結合區域再礦化效果的簡易操作混合粘接劑或根管沖洗液是牙本質脫礦藥物的發展方向[59]。采用計算機控制系統對人工口腔的精確動態調控尚需更多的研究和改進，以降低成本。新型酸蝕粘接藥物、根管治療藥物逐漸趨向更具有生物安全性的天然提取物。