油棕多胺合成酶基因的分離及其在低溫和脫水脅迫下的表達分析

金龍飛，尹欣幸，張安妮，曹紅星

（中國熱帶農業科學院椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌 571339）

0 引言

【研究意義】油棕（ Elaeis guineensis ）是重要的熱帶木本油料作物，其果實壓榨的棕櫚油在食品加工業、輕工業以及生物能源等領域有著廣泛的應用[1,2]。油棕原產于非洲西部的熱帶雨林中，性喜高溫和濕潤氣候，油棕種植在熱帶北緣地區常受到低溫脅迫的為害，熱帶地區季節性干旱也會影響油棕的生長和產量[3,4]。挖掘和鑒定與低溫和干旱應答相關的基因，研究油棕的逆境應答分子機制，對油棕遺傳改良和栽培選育具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】多胺是植物由2個或2個以上氨基組成的一種小分子帶陽性電荷的脂肪族有機化合物，包括腐胺、精胺、亞精胺、熱精胺等[5]。多胺在植物生長發育過程中起著重要的調控作用，參與植物的細胞增殖、形態發生以及對多種生物和非生物脅迫的響應[5]。大量的研究表明多胺的合成受到低溫、干旱、鹽堿、病原菌侵染等脅迫的誘導[6－8]，外源噴施多胺也能顯著增強植物對脅迫的耐受能力[9－11]。多胺的合成途徑有2條，精氨酸脫羧酶途徑和鳥氨酸脫羧酶途徑。而在擬南芥中的研究發現其多胺合成主要是通過精氨酸脫羧酶途徑[12]。精氨酸在精氨酸脫羧酶（ADC），鯡精胺亞氨基水解酶（AIH），N-氨甲酰腐胺-酰胺水解酶（CPA）3種酶的催化下產生腐胺；腺苷甲硫氨酸在腺苷甲硫氨酸脫羧酶（SAMDC）催化下產生氨丙基；腐胺與氨丙基在亞精胺合成酶（SPDS）的催化下生成亞精胺（Spd）；亞精胺在精胺合成酶（SPMS）和熱精胺合成酶（ACL5）的作用下分別生成精胺（Spm）和熱精胺（Tspm）[13]。其中ADC、SPDS、SPMS、ACL5和SAMDC是該途徑中的關鍵酶，在植物響應非生物及生物脅迫中起著重要的調控作用[14]。在擬南芥中超量表達枳的PtADC1能夠促進腐胺的合成和根系生長，進而提高轉基因植株對干旱和低溫的耐受性[8]；超量表達SaADC1能夠活化CBF的表達，進而顯著提高轉基因馬鈴薯對低溫的耐受性[15]；在苜蓿中的研究發現超量表達MtADC基因能夠促進脯氨酸和精胺，增強對鹽害的耐受性[16]。在擬南芥中超量表達羊草的LcSAMDC1基因能夠提高轉基因植株在低溫脅迫下精胺的含量，進而增強抗冷性[17]；在擬南芥中超量表達甜菜的BvM14-SAMDC基因能夠提高鹽脅迫下精胺和亞精胺的含量，增強抗氧化能力，進而提高鹽害的耐受性[18]。在茄子中的研究發現SmMYB44通過活化SmSPDS的表達，提高亞精胺的含量，進而增強對茄子青枯病的抗性[19]?！颈狙芯康那腥朦c】隨著油棕基因組測序工作的完成，基于全基因組數據庫挖掘功能基因成為可能[20]。多胺在植物生長發育和逆境脅迫應答中起著重要的調控作用，而在油棕中的相關研究尚待深入研究?！緮M解決的問題】本研究以擬南芥和水稻多胺合成酶的氨基酸序列為參照序列，在油棕基因組中進行比對獲得候選基因，再通過染色體定位、數據庫功能注釋、基因結構、進化樹分析確定其家族分類和可能具有的功能，同時采用實時熒光定量PCR分析多胺合成酶基因在油棕低溫和脫水脅迫中的表達模式，以期為培育油棕抗性品種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和脅迫處理

油棕 厚殼種Dura葉片采自中國熱帶農業科學院國家熱帶棕櫚種植資源圃（東經110.77°，北緯19.53°），采集油棕第17～20位葉片中部的小葉分別置于人工氣候箱進行低溫和脫水處理模擬低溫和干旱脅迫。人工氣候箱參數設置為光照（5 000 Lx）16 h，黑暗8 h，低溫處理：設置溫度為8 ℃，濕度為80%。脫水處理：設置溫度為25 ℃，濕度為50%。分別在低溫處理0 、6 、12 、24 、36 、48 h取樣，在脫水處理0 、0.5 、1、3 、6 、12 h取樣，將0 h的葉片作為對照[21]。樣品采集后液氮速凍后 置于超低溫冰箱中用于RNA提取。

1.2 油棕多胺合酶基因的挖掘

從擬南芥基因組數據庫（https://www.arabidopsis.org/）下載多胺合成酶的氨基酸序列，從NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=rice）中下載水稻多胺合成酶的氨基酸序列，以擬南芥和水稻的多胺合成酶的氨基酸序列作為參考序列，通過BLSATP在油棕基因組數據庫中進行比對。利用在線工具ExPAsy（http://www.expasy.org）分析油棕多胺合成酶基因的蛋白質分子量、等電點、蛋白不穩定指 數、脂溶指數和總平均親水性等理化性質。

1.3 油棕多胺合成基因的生物信息學分析

油棕多胺合成酶基因家族的基因結構、蛋白保守基序、保守結構域和染色體定位均采用Tbtool[22]進行可視化分析。采用ClustalW[23]對油棕和其他植物多胺合成酶蛋白質序列進行多重比對，采用MEGA6.0的Neighbor-joining法進行建樹，分析進化關系，設置校驗值bootstrap為1 000。從NCBI數據庫中下載油棕多胺合成酶基因CDS上游2 000 bp的序列，采用Plant Care[24]進行順式作用元件分析，采用Tbtool進行可視化[22]。油棕的根（SRR851071）、莖尖（SRR851103）、葉（SRR851096）、花（SRR851108）和花后15周（SRR190698）、17周（SRR190699）、21（SRR190701）和23周（SRR190702）果肉的轉錄組數據從NCBI的SRA數據庫（https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?）中下載。采用RPKM值對轉錄組數據進行歸一化處理，利用基迪奧云平臺在線工 具（https://www.omicshare.com/tools/）繪制熱圖。

1.4 油棕多胺合成基因的qRT-PCR分析

總RNA提取參照柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（上海生工）的操作說明進行。cDNA合成參照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis（大連寶生物）試劑盒的操作說明進行。qRT-PCR參照SYBR?Select Master Mix（大連寶生物）的操作說明進行。反應體系采用10 μL體系，每個反應加入cDNA模板1 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，SYBR?Select Master Mix 5 μL，雙蒸水3 μL。qRT-PCR反應程序為95 ℃預解鏈2 min，95 ℃解鏈5 s，退火和延伸20 s，循 環40次。每個反應重復4次。引物序列見表1。

表1 油棕多胺合成酶基因qRT-PCR引物序列Table 1 Sequence of qRT-PCR primer of polyamine synthase genes in oil palms

1.5 數據分析

本研究采用SPSS 13.0進行數據分析，用Ducan檢測法進行基因表達的差異顯著性分析。圖表采用E xcel、TBtool和MEGA 6.0繪制。

2 結果與分析

2.1 油棕多胺合成酶基因的鑒定

分別以擬南芥和水稻多胺合成酶基因的氨基酸序列為參照序列在油棕基因組中比對，獲得的15個不同的序列與擬南芥和水稻多胺合成酶基因高度相似。這15個基因分別被命名為亞精胺合成酶（EgSPDS1、EgSPDS2），精 胺 合 成 酶（EgSPMS1、EgSPMS2），熱精胺合成酶（EgACL5-1，EgACL5-2，EgACL5-3），精氨酸脫羧酶（EgADC1、EgADC2），S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（EgSAMDC1、EgSAMDC2、EgSAMDC3-1、EgSAMDC3-2、EgSAMDC4-1、EgSAMDC4-2）。油棕亞精胺合成酶、精胺合成酶熱精胺合成酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的氨基酸長度較短，為300左右，精氨酸脫羧酶的氨基酸長度較長，為700左右。油棕多胺合成酶氨基酸的分子量在36.00～76.58 KDa，等電點在4.80～6.31，偏酸性。EgACLs的蛋白不穩定指數在40以下，為穩定蛋白；其余均大于40，為不穩定蛋白。油棕多胺合成酶脂溶指數在76.46～94.41，平均為83.8。EgADCs的總平均親水性大于0，EgSAMDC3-1的 總平均親水性為0，其余均小于0（表2）。

2.2 油棕多胺合成酶的生物信息學分析

油棕共有16條染色體，對多胺合成酶基因進行染色體定位，發現EgSPMS1和EgACL5-2定位Chr1上，EgSAMDC3-2定位在Chr2上，EgSPMS2和EgACL5-3定位在Chr3上，EgADC2定位在Chr4上，EgSAMDC4-1定位在Chr5上，EgSPDS2和EgSAMDC3-1定位在Chr8上，EgSAMDC4-2和EgACL5-1定位在Chr10上，EgSPDS1、EgSAMDC1、EgSAMDC2和EgADC1未能定位在染色體上，分布在3個Scaffolds上（圖1）。利用MEME在線工具分析保守蛋白基序發現：EgSAMDCs含有基序1、3、5、6、8、10，EgADCs含有基序9，EgACL5s含有基序2、4、6、9和EgSPDSs含有基序1、2、4、6、7、9。利用Batch Web CD-Search Tool分析蛋白保守結構域發現：EgSAMDCs含有特定保守域PLN02524，EgADCs含有特定保守域PLN02439，EgACL5s含有特定保守域PLN02823，EgSPDSs含有特定保守域PLN02366（表2）?；蚪Y構分析發現：EgSPDS1和EgSPDS2有9個外顯子，EgSPMS1和EgSPMS2有11個外顯子，EgACL5-1、EgACL5-2和EgACL5-3有10個外顯子，EgSAMDC1有3個外顯子，EgADC1有2個 外 顯 子，EgADC2、EgSAMDC2、EgSAMDC3-1、EgSAMDC3-2、EgSAMDC4-1、EgSAMDC 4-2只有1個外顯子，沒有內含子（圖2）。將油棕的多胺合成酶氨基酸序列和其他植物進行進化分析，發現多胺合成酶基因一共分成3個家族：ADC家族、SPMS家族（包括SPMS，SPDS和ACL5）和SAMDC家族（圖3），其中EgSMADCs和EgADCs與水稻的親緣關系較近，EgACLs和EgSPDSs與椰棗的親緣關系較近，EgSPMSs與玉米的親緣關系較近。

圖1 油棕多胺合成酶基因在染色體上的分布Fig. 1 Chromosome location of polyamine synthase genes in oil palm

圖2 油棕多胺合成酶的進化關系、保守蛋白基序、結構域和基因結構分析Fig. 2 Phylogenetic relationships, architecture of conserved protein motifs and conserved domain, and gene structure of polyamine synthase genes in oil palm

圖3 油棕和其他植物多胺合成酶基因家族的進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of polyamine synthase genes in oil palms and other plants

表2 油棕多胺合酶基因的理化性質分析Table 2 Physicochemical properties of polyamine synthase genes in oil palms

在油棕多胺合成基因的啟動子中鑒定了大量與光響應、植物激素應答、防衛和逆境脅迫響應相關的順式作用元件，包括脫落酸響應（47個），赤霉素響應（8個）、光響應（165個）、茉莉酸甲酯響應（21）、傷害響應（3個）、生長素響應（8個）、防衛和和逆境脅迫響應（8個）、低溫響應（8個）、水楊酸響應（13個）、干旱響應（8個）（圖4），表明油棕多胺合成酶基因參與植物生長、植物激素和環境刺激的應答。

圖4 油棕多胺合成酶啟動子順式作用元件分析Fig. 4 Cis-acting elements in promoter of polyamine synthase in oil palms

如圖5所示，油棕多胺合成酶基因在不同組織中的表達模式差異較大，其中EgSAMDC2、EgSAMDC3-1和EgSPMS2在根中高表達，EgACL5-2在莖尖中高表達，EgADC2在葉中高表達，EgSAMDC1和EgSAMDC3-1在花中高表達，EgSPDS1和EgSPMS1在果中高表達，EgSAMDC4-1在花后15周的果肉中高表達，EgADC1、EgSPDS2和EgSAMDC3-2在花后23周的果肉中高表達。

圖5 油棕多胺合成酶基因在不同組織中的表達模式Fig. 5 Expressions of polyamine synthase genes in tissues of oil palms

實時熒光定量PCR結果顯示，油棕多胺合成酶基因的表達受到低溫和脫水脅迫的誘導表達。EgSPDS2、EgSPMS1、EgADC1、EgADC2、EgACL5-1、EgACL5-2、EgACL5-3、EgSAMDC3-1、EgSAMDC4-1和EgSAMDC4-2在低溫處理12 h后達到峰值，然后表達量降低并處于穩定水平（圖6）。EgSPMS2、EgSAMDC1和EgSAMDC3-2的表達量則是隨著低溫處理時間的延長逐漸降低（圖6）。EgSPDS1、EgSPDS2、EgADC1、EgADC2、EgSAMDC4-1和Eg SAMDC4-2、EgACL5-1的表達量受脫水脅迫誘導，在脫水1 h達到峰值，然后逐漸降低（圖7）。EgSPMS1、EgSPMS2、EgSAMDC3-1和EgSAMDC3-2的表達量隨著 脫水脅迫時間的延長逐漸降低（圖7）。

圖6 多胺合成酶基因在低溫脅迫下表達模式Fig. 6 Expressions of polyamine synthase genes under low-temp stress

3 討論與結論

隨著基因組測序技術的發展和生物信息學研究的不斷深入，大量植物完成了全基因組測序，這為植物基因家族的挖掘、鑒定和功能分析提供了有利條件，多胺合成酶基因也在多個物種中鑒定出來[7,8,25－27]。油棕作為世界上產油效率最高的油料作物，其多胺合成酶基因的研究尚未見報道，而油棕基因組測序工作的完成[20]，為油棕多胺合成酶基因的研究提供了參考。本研究從油棕基因組中鑒定了15個編碼多胺合成酶的基因，包括2個SPDS，2個SPMS，2個ADC，3個ACL5和6個SAMDC。油棕多胺合成酶的蛋白長度、分子量、等電點、蛋白不穩定指數、脂溶指數和總平均親水性、基因結構等基本特性存在較大差異，且都含有特定的保守基序和保守結構域（表2、圖2），與海棠、番茄和柑橘中的研究相似[21－27]。進化分析發現油棕多胺合成酶基因與同為單子葉植物的水稻、玉米以及棕櫚科植物的椰棗親緣關系較近（圖3）。

油棕多胺合成酶在不同組織中表達量差異很大，表明多胺合成酶在油棕發育的不同階段起重要的調控作用。EgSAMDC2、EgSAMDC3-1和EgSPMS2在根中的表達量顯著高于其他組織（圖5），表明多胺參與油棕根系發育的調控，與柑橘中的研究結果類似[21]。EgACL5-2在莖尖中的表達量顯著高于其他組織（圖5），而莖尖是油棕的頂端生長點，表明熱精胺合成酶在油棕的分生組織發育中起重要作用。在棉花中的研究也發現ACL5參與莖的發育，超量表達能夠顯著提高轉基因棉花的株高[28]。在樟子松中研究也發現ACL5參與維管組織發育的調控[24]。EgSPDS1、EgSPDS2、EgSPMS1、EgADC1、EgSAMDC3-2、EgSAMDC4-1在果實中表達量顯著高于其他組織（圖5），這表明多胺還參與油棕果實發育的調控。番茄中的研究也有類似的結果，精胺和亞精胺在果實發育前期大量積累，腐胺在果實發育后期大量積累，對應的多胺合成酶基因也呈現出相似的表達模式[29]。

油棕原產于非洲幾內亞灣的熱帶河谷地帶、性喜溫暖、濕潤的氣候，低溫和干旱脅迫會嚴重影響油棕生長和產量[30,31]。多胺是植物體內一類低分子量脂肪族胺，廣泛參與植物的生長發育和逆境脅迫應答反應，大量研究表明多胺合成酶參與植物對各種生物及非生物脅迫的響應[13,14,32]，采用基因工程的手段超量表達多胺合成酶基因，能夠增強轉基因植物對脅迫的耐受性[15,16,18,33]。在本研究中，EgSPDS1、EgSPDS2、EgSPMS1、EgADC1、EgADC2、EgACL5-2、EgACL5-3、EgSAMDC3-1、EgSAMDC4-1、EgSAMDC4-2和EgACL5-1受低溫脅迫的誘導（圖6），EgSPDS1、EgSPDS2、EgADC1、EgADC2、EgSAMDC4-1和EgSAMDC4-2、EgACL5-1的表達量受脫水脅迫誘導（圖7），表明多胺合成酶基因參與油棕對低溫和脫水脅迫的應答。同時，在多胺合成酶基因的啟動子上也發現大量與脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、低溫、干旱脅迫響應相關的順式作用元件（圖4），表明油棕的多胺合成酶基因的表達受植物激素和逆境脅迫的調控。本研究對油棕多胺合成酶基因的功能進行了初步的鑒定，在后續的研究中還需要利用轉基因技術或基因編輯技術對這些基因的功能和作用機制進行驗證。

圖7 多胺合成酶基因在脫水脅迫下表達模式Fig. 7 Expressions of polyamine synthase genes under draught stress