砂梨石細胞含量多樣性及其分級指標

范 凈，陳啟亮，楊曉平，張靖國，杜 威，胡紅菊

（湖北省農業科學院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064）

0 引言

【研究意義】梨（Pyrus. L）是適應性極強的落葉果樹，廣泛種植于我國南北各地。梨果實脆嫩可口，有生津潤肺、止咳化痰的功效，是消費者喜愛的日常必備水果之一。我國是梨屬植物的起源中心，種質資源豐富多樣。我國梨種質資源的保存量、梨樹栽培種植面積產量和梨果消費量均居世界首位[1]。石細胞是木質素沉積在初生細胞壁并在細胞壁次生增厚而形成的，是梨果實特有性狀，也是影響梨果實品質的重要因素[2]。碭山酥梨中石細胞密度和聚合度較高是導致碭山酥梨鮮食品質較差的主要原因[3]，庫爾勒香梨生產上出現的粗皮果、青頭果等品質下降的現象也與石細胞含量增多有密切關系[4]，因此探討梨種質資源石細胞特性及其遺傳變異特點對有效開展梨品質育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國內外關于石細胞研究主要集中在梨果實石細胞形成特點和發育規律分析[5－6]，梨果實石細胞解剖結構和超微結構觀察[7－8]，不同品種石細胞含量及木質素含量的分析[3,9－10]，木質素代謝相關基因調控解析[11－12]，石細胞形成過程的細胞程序性死亡調控機制研究[4,13－14]，梨種間不同品種石細胞含量檢測分析也有見報道[9]?！颈狙芯壳腥朦c】砂梨Pyrus pyrifolia（Burm.）Nakai 作為我國梨屬植物栽培種之一，主要分布于我國長江流域及以南的區域，種質資源豐富，但砂梨不同品種的石細胞評價尚不全面，特別是梨種質資源石細胞含量分級指標在砂梨種質資源評價上的應用尤其不足?！緮M解決的關鍵問題】系統全面地分析砂梨種質資源石細胞含量多樣性有助于明晰不同種質類型和不同來源的石細胞含量特征，篩選出特異種質資源可用于石細胞代謝機理研究和品質育種，提升種質資源的有效利用效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取湖北省農業科學院果樹茶葉研究所“國家果樹種質武昌砂梨圃”的480份盛果期砂梨種質資源，砂梨樹為8～12年生健壯樹，栽培管理水平一致。480份不同砂梨種質資源分為地方品種、國外引進品種和國內選育品種（品系），其中國外引進品種和國內選育品種（品系）包括具有砂梨親緣關系的品種 資源。

1.2 試驗方法

2015—2019年，在每個砂梨種質樹外圍結果枝的東西南北4個方向各取成熟果實10個，再從不同果實上取果肉切塊混合，根據四分法每份分成90～110 g 于－20 ℃冷凍，每個品種3次重復。

石細胞含量按聶繼云等[15]的方法測定。90～110 g果肉于－20 ℃冷凍24 h，在20 000 r·min－1下勻漿3 min，勻漿后液體倒入1 000 ml玻璃燒杯，加水用玻棒攪拌10 s后靜置5 min，倒出上層懸浮物，重復漂洗4次，下層石細胞經濾紙過濾收集后置電熱鼓風式烘箱70 ℃烘3 h，干燥石細胞用電子天平進行稱量。石細胞含量（%）（Stone cell content，SC）=[稱量的石細胞質量（g）/每份樣品實際果肉重量（ g）]×100。

1.3 數據分析

采用Excel 2007對480份砂梨種質資源的石細胞含量數據進行平均值統計，并根據不同種質類型和不同來源地分類計算遺傳多樣性Shannon's信息指數（H′）指數，SPSS 21.0軟件對平均石細胞含量數據進行最大值、最小值、變異系數、分布頻次和正態分 布分析。

2 結果與分析

2.1 不同砂梨種質資源石細胞含量分析

480份不同砂梨種質資源的石細胞為0.043%～2.748%，分布頻次表明石細胞含量呈正偏態分布，70.63%砂梨種質資源石細胞含量集中在0.20%～0.90%（圖1）。供試樣品的平均石細胞含量0.706%，標準差為0.431，變異系數為61.11%，遺傳多樣性S hannon's信息指數（H′）為1.95。

圖1 480份砂梨種質資源石細胞含量分布頻次Fig. 1 Frequency distribution of SC contents of 480 sand pear germplasms

2.2 不同種質類型砂梨石細胞含量多樣性分析

按照地方品種、國外引進品種和國內選育品種（品系）的不同種質類型評價480份砂梨石細胞含量變化多樣性（表1）。結果顯示不同種質類型砂梨平均石細胞含量表現為地方品種（0.886%）＞國外引進品種（0.440%）＞國內選育品種（品系）（0.400%）；變異系數表現為地方品種（48.82%）＞國外引進品種（48.79%）＞國內選育品種（品系）（47.02%）；多樣性指數表現為國內選育品種（品系）（2.01）＞國外引進品種（2.00）＞地方品種（1.98）。說明地方品種果實中平均石細胞含量最多，變異系數最高，多樣性指數最??；國內選育品種（品系）果實中平均石 細胞含量最少，變異系數最低，多樣性指數最大。

表1 不同種質類型砂梨石細胞的多樣性評價Table 1 Diversity of sand pear germplasms based on SC content

2.3 地方品種不同來源砂梨石細胞含量多樣性分析

299份地方砂梨品種以不同來源地分析遺傳多樣性，結果顯示地方品種不同省份來源的砂梨平均石細胞含量表現為云南（1.239%）＞四川（1.091%）＞貴州（0.966%）＞湖南（0.905%）＞湖北（0.865%）＞廣東（0.820%）＞廣西（0.812%）＞福建（0.620%）＞江西（0.612%）＞浙江（0.595%）；變異系數表現為云南（51.07%）＞湖北（49.92%）＞四川（46.46%）＞貴州（39.03%）＞湖南（30.85%）＞廣西（27.31%）＞福建（26.80%）＞江西（21.81%）＞浙江（21.35%）＞廣東（14.02%）；多樣性指數表現為四川（1.90）＞貴州（1.88）＞湖北（1.82）＞云南（1.64）＞湖南（1.63）＞福建（1.56）＞廣西（1.49）＞江西（1.25）=浙江（1.25）＞廣東（0.95）。說明來自云南地方品種的平均石細胞含量最多和變異系數最高，四川地方品種的多樣性指數最大；浙江地方品種的平均石細胞含量最少，廣東地方品種的變異系數最低且多樣 性指數最?。ū?）。

表2 地方品種不同省份的石細胞含量多樣性評價Table 2 SC content-based diversity of sand pear germplasms from different provinces in China

2.4 國外引進品種和國內選育品種（品系）不同來源的石細胞含量多樣性分析

國外引進的砂梨品種主要是來源于日本和韓國，日本品種的平均石細胞含量和多樣性指數均高于韓國品種，韓國品種的變異系數大于日本品種（表3）。國內選育品種（品系）平均石細胞含量表現為西南地區（0.483%）＞華中地區（0.393%）＞華東地區（0.372%）；變異系數表現為西南地區（57.67%）＞華東地區（49.34%）＞華中地區（43.41%）；多樣性指數表現為華中地區（2.04）＞華東地區（1.94）＞西南地區（1.78）（表3）。說明來自我國西南地區的選育品種平均石細胞含量最多和變異系數最高但多樣性指數最??；華東地區選育品種平均石細胞含量 最少，華中地區變異系數最低但多樣性指數最大。

表3 國外引進品種不同國家和國內選育品種不同區域的石細胞含量多樣性評價Table 3 SC content-based diversity of cultivars from foreign countries and those selected for breeding from regions in China

2.5 砂梨石細胞含量分級指標比較

按照梨種質資源石細胞含量分級與指標[16]，480份供試砂梨樣品的石細胞含量分為5級，其中極多（SC≥0.8%）的資源有158份，占樣品量的32.92%。砂梨石細胞含量的平均值0.706%和中位數0.635歸為石細胞含量多（0.5%≤SC＜0.8%）的范圍。采用梨種質資源石細胞含量分級指標對砂梨石細胞含量進行分級，明顯表現為向石細胞含量多的偏離（表4）?；诒狙芯恐械?80份砂梨種質資源石細胞含量為正偏態（Skewness=1.3）和中位數為0.635的特點，在級差為0.2水平的等差分級和級差為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5的梯度差將砂梨石細胞含量分為7級指標（表4），對比梨種質資源石細胞含量分級指標，砂梨石細胞等差分級和梯度差分級的7級指標都將不同種質資源離散分布在不同級別，其中砂梨石細胞梯度差分級指標評價的種質資源分布更接近正態分布?；诖颂岢鰞灮纳袄媸毎吭u價7級梯度差分級指標。

表4 砂梨石細胞含量分級指標比較Table 4 Grading standards for sand pear germplasms based on SC content

按照優化的砂梨石細胞含量評價7級梯度差分級指標，供試的480份砂梨石細胞資源分為極少15份、少22份、較少81份、中153份、較多141份、多47份和極多21份，占比分別為3.12%、4.58%、16.88%、31.88%、29.37%、9.79%和4.38%。15份石細胞含量極少的資源包括國內選育品種（品系）8份，如‘翠冠’（0.043%）、‘青魁’（0.052%）、‘蘇翠1號’（0.063%）等；國外引進品種7份，如‘萬豐’（0.052%）、‘豐水’（0.053%）、‘圓黃’（0.059%）等。

3 討論與結論

本研究中砂梨石細胞含量的平均值為0.706%，大于曹玉芬等[9]對89份砂梨品種石細胞含量平均值0.552%?？赡苁且驗楣┰嚇悠返牡胤狡贩N較多，占供試樣品的62.29%，地方品種的平均石細胞含量0.868%，大于480份砂梨石細胞含量的平均值。部分砂梨品種在湖北武漢檢測得到的石細胞含量與遼寧興城的檢測結果有所不同，比如曹玉芬等[9]檢測‘雪峰’ ‘滿頂雪梨’ ‘清香’的石細胞含量分別為0.256%、0.298%和0.147%，而在本試驗中這3個品種的石細胞含量分別為0.181%、0.202%和0.271%，這可能是因為同一品種在果實生長發育過程中石細胞積累受環境或氣候的影響而造成的差異?！畮鞝柪障憷妗麑嵃l育過程中石細胞與細胞凋亡的相關研究也表明，在細胞分化旺盛期的梨果實發育早期，木質素沉積受樹體營養和環境因素的影響，部分細胞凋亡或分化形成石細胞積累[4]。

不同種質類型石細胞含量的多樣性分析表明，國內選育品種（品系）和國外引進品種的平均石細胞含量變低，說明人工選育過程中石細胞含量被馴化改良而減少，石細胞含量的性狀是梨馴化過程中的功能缺失性突變[17]。地方品種的多樣性指數小可能是因為供試地方品種62.54%樣品平均石細胞含量集中在0.661%～1.075%，而國內選育品種的多樣性指數大，可能是因為品質改良過程中不僅減少了石細胞的含量，還豐富了選育品種的遺傳背景，導致國內選育品種多樣性豐富度高于地方品種。

地方品種不同省份石細胞含量多樣性分析表明，西南地區的云南、貴州和四川的平均石細胞含量、變異系數和多樣性指數高于其他省份，可能是因為中國砂梨品種起源于長江流域及其以南地區野生的砂梨[18]，西南地區的地方品種可能多是來源于該地的野生砂梨的馴化。國內選育品種石細胞含量多樣性分析表明，中國華東地區和華中地區的選育品種石細胞含量低于西南地區。西南地區選育品種石細胞含量相對較高，可能是該地區選育品種大多是地方品種‘金花梨’實生選育而來，金花梨石細胞含量為0.942%，按照本研究中優化的分級評價指標，金花梨石細胞含量屬于較多級別，以金花梨為親本選育的后代雖然在石細胞含量上有一定的減少，但是遺傳背景單一改良程度不明顯。國外引進的砂梨品種多數是日本和韓國的選育品種，日本引進品種平均石細胞含量較高，韓國引進品種多樣性指數最小，可能是因為日本和韓國的選育品種多是以‘二十世紀’培育而來[19]，品種同質化嚴重。

種質資源的分級指標是種質資源鑒定評價描述規范化和標準化的基礎，但是梨種質資源石細胞含量分級指標應用于砂梨石細胞含量的性狀評價時資源分布情況近似負偏態，不能很好地表現資源分布的離散情況，不利于砂梨石細胞含量的性狀優異資源篩選。石細胞含量性狀為數量性狀，當樣本量足夠大時可以代表某一群體的變異情況，本研究中砂梨資源480份基本可以代表該群體的遺傳多樣性，因此根據砂梨資源石細胞含量數據優化的分級指標是可靠的，比較砂梨石細胞含量等差分級和梯度差分級的7級指標，采用砂梨石細胞7級梯度差分級指標進行評價，砂梨種質資源石細胞含量性狀在各級的分布離散比例更接近正態分布。

按照本研究優化的7級梯度差分級指標，篩選出的優異種質資源將為種質資源有效利用提供直接的材料支撐。梨雜交后代果實石細胞含量性狀遺傳傾向研究表明，雜交后代向石細胞多的方向遺傳力較強，后代石細胞含量呈增多趨勢，以石細胞少為育種目標時最好選擇石細胞含量少的資源為親本[20]。本研究中篩選出的石細胞含量極少（SC＜0.1%）的‘翠冠’ ‘蘇翠1號’ ‘豐水’ ‘日光’ ‘幸水’ ‘萬豐’ ‘新一’等種質資源可以作為優異親本用于砂梨石細胞性狀改良。不同石細胞含量品種可用于遺傳群體構建和石細胞檢測方法的創新，Xue等[21]利用不同石細胞含量的品種開發出石細胞數字圖像的掃描評價程序，應用該系統可以定量評價石細胞的數量、大小、面積和密度。石細胞含量極少和極多的種質資源可用于木質素代謝的研究，在梨木質素代謝的研究中，研究者通過30份低石細胞含量和30份高石細胞含量不同梨品種的Pbrmir397a啟動子區DNA多態性分析，進一步闡明Pbrmir397a是通過抑制木質素生物合成關鍵酶漆酶（LAC）基因來調節梨果實石細胞發育過程中的木質素代謝[22]。Wang等[23]以2份不同石細胞含量的秋子梨為研究材料，分析木質素在果實發育過程中的沉積，酚類代謝產物變化和木質素合成基因的表達，揭示了木質素在果實發育過程中代謝的分子機制。

本研究對480份不同種質類型和不同來源的砂梨種質資源石細胞含量性狀進行遺傳多樣性分析，砂梨石細胞含量性狀遺傳多樣性豐富，地方品種的平均石細胞含量最高，國內選育品種（品系）遺傳多樣性指數最大。在砂梨石細胞含量性狀評價基礎上優化石細胞含量分級指標，建立砂梨石細胞含量評價的7級梯度差分級指標。篩選出的不同石細胞含量的特異種質資源可用于梨優良品種改良和木質素代謝調控的研究，提升種質資源的利用效率。