甜瓜再生體系的建立

祁宏英 徐洪國 王秀文 王芳 尹幫果 高美玲

摘 要：以葫蘆科的甜瓜為試驗對象，探討不同基因型、不同激素濃度配比及抗生素脅迫對其不定芽萌發的影響，以期建立甜瓜再生培養體系，為甜瓜遺傳轉化奠定基礎。結果表明，甜瓜在初代培養時，不定芽發生的培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA，甜瓜再生率最高，達到92.5%;甜瓜在繼代培養中，0.3 mg·L-1 6-BA的處理最適宜不定芽的伸長生長，0.7 mg·L-1 6-BA的處理甜瓜不定芽增殖系數最高達到2.33;當Kan（卡那霉素）質量濃度大于 20 mg·L-1 時，外植體基本全部褐化，無法分化出綠芽。Amp（氨芐青霉素）在一定質量濃度下對不定芽發生的影響差異性不顯著。

關鍵詞：甜瓜;不定芽;再生;抗生素

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）05-105-04

Optimization of regeneration system of melon

QI Hongying1，2， XU Hongguo1，2， WANG Xiuwen1， WANG Fang1，2， YIN Bangguo1， GAO Meiling1，2

（1.College of Life Science and Agriculture Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China; 2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： In this experiment， the effects of different hormone combinations on the regeneration system of different genotypes of melon were studied，and the effects of different hormone combinations and genotypes on the regeneration of melon lines were studied， and the effects of antibiotics on the tolerance of adventitious buds of melon were explored. The aim was to optimize the regeneration culture system of muskmelon and lay the foundation for genetic transformation of melon. The results showed that when the medium of adventitious bud was MS+1.0 mg·L-1 6-BA， the regeneration rate of muskmelon was the highest up to 92.5%. The concentration of 0.3 mg·L-1 6-BA in muskmelon was the most suitable for the growth of adventitious buds. Under the concentration of 0.7 mg·L-1 6-BA， the highest multiplication coefficient of adventitious buds was 2.33. When the concentration of Kan was higher than 20 mg·L-1， the explant was browning and could not differentiate into green buds. There was no significant difference in the effect of certain concentration of Amp on adventitious bud formation.

Key words： Melon; Adventitious buds; Regeneration; Antibiotics

甜瓜（Cucumis melo）是全國乃至全球普遍種植的一種經濟作物，果實口感佳、營養豐富、品味獨特，是一種廣受人們喜愛的食用果品[1]。大多數研究表明，植物的基因型是其器官發生的主要影響因素。隨著植物基因工程的發展，通過轉基因技術改良甜瓜品質成為新的研究熱點，這為提高甜瓜品質和抗逆性開辟了更加安全可靠、快捷可行的途徑[2-3]。建立甜瓜高效再生體系是遺傳轉化的基礎，基因型不同，其再生能力也會受到很大的影響，種間、品種之間的再生能力、再生頻率差異顯著[4-6]。在農桿菌介導的培養轉化過程中，一個很重要的環節是抑制農桿菌的生長，防止農桿菌過度增殖對植物組織細胞造成傷害和影響植株的再生，這就需要用抗生素及時有效地抑制，要求使用的抗生素在不傷害或少傷害受體材料的同時能完全抑制農桿菌的生長[7]。筆者以葫蘆科的甜瓜為試驗對象，研究不同基因型、不同激素濃度配比及抗生素脅迫對其不定芽萌發的影響，探究其變化規律，優化甜瓜的再生體系，為利用生物技術培育具有抗病蟲害、抗逆性等優良農藝性狀的甜瓜及其他農作物品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜材料T3、T4、T8、T18、T35、82ck、81×83均由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院西甜瓜課題組提供。試驗于2018年4—6月在齊齊哈爾大學生命科學與農林學院植物組織培養實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒 挑選大小均一、籽粒飽滿的種子于清水中浸泡6～8 h，種子去殼;在75%的乙醇中振蕩30 s倒出乙醇，用無菌水清洗2次，倒入0.1%氯化汞浸沒種子，均勻晃動5～8 min;倒出氯化汞，再使用無菌水清洗 4～6次，每次約30 s;倒出里面的無菌水，種子表面的水分用無菌濾紙吸干。

1.2.2 甜瓜無菌苗培養 參照孔維萍等[8]的方法，將消毒的甜瓜種子在無菌環境下接入1/2 MS培養基中，平置，每瓶5 粒種子;暗培養2 d后轉入25 ℃、1600 lx光照16 h/黑暗8 h條件下，培養3 d，統計成活率。

1.2.3 甜瓜不定芽的誘導 將生長5 d左右的甜瓜81×83無菌苗子葉外植體接種于MS培養基上， 該培養基附加不同濃度的6-BA、NAA。在光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h、溫度25 ℃條件下培養。21 d后統計甜瓜外植體的出愈率和出芽率。

1.2.4 甜瓜不定芽的伸長及繼代增殖培養 將甜瓜81×83不定芽誘導中獲得的有效芽接入不同質量濃度6-BA（0～0.7 mg·L-1）的培養基中進行不定芽伸長及繼代增殖培養實驗，培養環境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度 25 ℃。培養20 d后，觀察并統計不定芽伸長及增殖情況。

1.2.5 甜瓜不定芽生根 基本培養基為1/2 MS培養基。挑選長度為3～5 cm的甜瓜81×83無根苗，用手術刀切除底部多余的愈傷組織，將無根苗接入分別添加不同濃度 NAA的1/2 MS培養基中。每個處理接種10瓶，每瓶接4株無根苗。培養環境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度25 ℃，觀察生根情況。

1.2.6 不同基因型甜瓜子葉節不定芽發生情況 將7種不同基因型的甜瓜種子，按照前述方法進行無菌苗培育，切取子葉節外植體，在MS+6-BA 1.0 mg·L-1培養基中進行不定芽誘導。

1.2.7 抗生素對甜瓜不定芽耐受性的影響 配制前期所得的不定芽最佳培養基MS+6-BA 1.0 mg·L-1培養基，加完瓊脂煮沸后用量筒量取40 mL，倒入錐形瓶中，將瓶口封好放入121 ℃、20 min下高壓滅菌。將抗生素過濾滅菌后分別添加0、5、10、15、20、30 mg·L-1卡那霉素（Kan），0、50、100、150、200、300 mg·L-1氨芐青霉素（Amp）。選擇再生無菌苗葉片1.0 cm2葉盤接入培養基中，每個處理接種10瓶，每個瓶接4個外植體，接種完后，封口，放入光照培養室中進行恒溫光照培養。培養環境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度25 ℃。21 d后統計子葉不定芽發生情況。

1.3 統計與分析

成苗率/%=成苗數/接種數×100;再生頻率/%=發生不定芽的外植體數/供試外植體總數×100;增殖系數/%=（新增芽數+伸長芽數）/供試再生芽數×100;生根率/%=生根外植體數/供試外植體總數×100。

借助SPSS 19.0 統計軟件，采用Duncan多重比較法進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 甜瓜無菌苗萌發

從表1可以看出，甜瓜種子的發芽率也因基因型的不同而出現較大的差異，成苗率為10%～93%，T35、82ck基因型的甜瓜種子發芽率均達到90%及以上，而T8基因型的甜瓜種子成苗率只有10%。出現此現象可能是由于種子狀態不佳，此基因型的種子殼大，易破，且種仁極軟，在去殼過程中遭到一定程度的破壞。

2.2 甜瓜不定芽發生

2.2.1 不同激素組合對甜瓜不定芽發生的影響 從表2中可以看出，在1.0 mg·L-1 6-BA培養基條件下，甜瓜不定芽再生頻率最高，達到92.5%;而分布在此質量濃度左右的，質量濃度較低的不定芽發生不明顯，而質量濃度較高的會有一定的抑制作用，6-BA 0.5 mg·L-1的不定芽再生頻率較低，只有37.5%，具有較大的差異性，隨著質量濃度的增加，不定芽的再生頻率降低，2.0 mg·L-1 6-BA不定芽再生頻率只有32.5%，低于0.5 mg·L-1 6-BA的再生頻率，說明6-BA對于不定芽的再生頻率隨著激素質量濃度的升高而升高，但到一定質量濃度后，再生頻率開始下降，有一定的抑制作用。在添加NAA 0.1 mg·L-1的4個處理中，不定芽再生頻率也在1.0 mg·L-1 6-BA時達到最高，為67.5%。從表2數據可以看出，在同等6-BA質量濃度、添加NAA激素培養條件下，不定芽的出芽率明顯低于不添加NAA的培養基，并且在培養后期，少量添加NAA的培養基已生根。

2.2.2 不同甜瓜材料不定芽發生情況 從表3可以看出，T35的不定芽再生頻率最高，達到87.5%;T4的次之，為71.87%;T3的再生頻率為59.37%，居于第三;T18、81×83、82ck、的相對較低，分別為53.12%、50.00%和37.50%;T8的再生頻率最低，只有10.00%。7個甜瓜材料子葉外植體不定芽的發生出現了極性，大部分不定芽是發生在近軸切口處，而遠軸切口處不定芽發生數較少。T35和T18材料的外植體在接種后，出現近軸端傷口變得較為寬闊，從而發生了數目極多的不定芽。

2.3 不定芽的伸長及增殖培養

甜瓜不定芽的最適宜伸長培養基為MS+6-BA 0.3 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%瓊脂（表4）。在這種激素質量濃度下，不定芽生長的速度最快，且沒有出現玻璃化現象，經15 d就可以獲得3～5 cm高且健壯的試管苗;當激素質量濃度逐漸升高時，發現新增不定芽數也逐漸增加，MS+6-BA0.7 mg·L-1條件外植體增殖系數最高，為2.33，這一結果與前期不定芽誘導結果相似， 6-BA質量濃度越接近1.0 mg·L-1，不定芽發生越多。

2.4 生根培養

無根苗的生根情況，從表5可以看出，對照的生根率最高，達到90%，當NAA激素質量濃度逐漸升高時，無根苗的生根率逐漸下降，高質量濃度的NAA對根的發生有一定的抑制作用。此試驗得出，無激素添加的培養基，生根率最高。

2.5 抗生素對甜瓜不定芽耐受性的影響

2.5.1 卡那霉素對甜瓜不定芽耐受性的影響 從4種質量濃度梯度Kan+MS+1.0 mg·L-1 6-BA的培養結果（表6）可以看出，甜瓜子葉愈傷組織形成受到了不同程度的影響，不定芽同樣受到了抑制;但是，添加了抗生素的培養基基本無污染，較好地抑制了菌的生長。隨著Kan質量濃度的增加，不定芽的發生數呈下降趨勢，當Kan的質量濃度達到20 mg·L-1時，外植體都發生大量的愈傷組織，但是發生不定芽的外植體很少，且不定芽數也極少;當Kan的質量濃度達到30 mg·L-1時，再生頻率為0。而5 mg·L-1的Kan與對照相比，再生頻率相對較高，由于對照中未添加抗生素，所以有一部分發生污染，少量的抗生素有效地抑制了菌的產生，間接提高了不定芽的再生頻率。

2.5.2 氨芐青霉素對甜瓜不定芽耐受性的影響 氨芐青霉素（Amp）對甜瓜不定芽再生的抑制作用不是很明顯，從表7可以得知，前4種Amp質量濃度的培養基中，無明顯抑制現象，當氨芐青霉素質量濃度為100 mg·L-1時，不定芽再生率最高，達到90.00%。當外植體處于0、50、100、150、200 mg·L-1 Amp條件下培養時，其再生能力并沒有較大程度的差異，當抗生素質量濃度上升到300 mg·L-1時，外植體不定芽再生頻率明顯降低，但再生頻率仍然能夠達到50%，因此，進行遺傳轉化時可以使用氨芐青霉素作為農桿菌生長的抑制劑。

3 討論與結論

由本文的結果可知，在芽誘導階段，甜瓜子葉外植體在不同激素質量濃度配比的MS培養基上可誘導出不定芽叢或愈傷組織。培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA時，再生率能達到92.5%，高質量濃度的6-BA誘導易出現叢芽，這與孫天國的試驗結果一致[9]。另外，子葉芽誘導時出現極性現象，即不定芽總是出現在子葉近軸端。對此也有許多國內外學者進行了研究和報道[10-11]。在芽伸長培養基的選擇上，筆者采用了低質量濃度的6-BA，發現將叢生芽轉接到含有0.3 mg·L-1 6-BA的改良分化培養基上伸長效果最好，這與張慧君[12]的實驗結果相似。在利用農桿菌介導的遺傳轉化過程中，在選擇培養階段由于抑制農桿菌的生長而加入的抑菌素在一定程度上也會影響芽的分化和生長。在試驗中發現，在不定芽誘導過程中，加入少量的抗生素可抑制菌的產生，試驗結果顯示100 mg·L-1的氨芐青霉素可以抑制菌的生長，一定程度促進了不定芽的分化，質量濃度升高至300 mg·L-1時，對不定芽的分化有一定的抑制作用，再生頻率顯著下降，因此，進行遺傳轉化時可以使用氨芐青霉素作為農桿菌生長的抑制劑。

參考文獻

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