昆布散對甲狀腺腫大大鼠甲狀腺功能及氧化應激的影響

趙慎非,黃莉莉,黃鳴清,張怡評,林思榮,邱遠望

(1.福建省食品藥品質量檢驗研究院，福建 福州 350001；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350108；3.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發利用工程技術創新中心,福建 廈門 361005；4.福建中益制藥有限公司，福建 石獅 362712)

甲狀腺是人體最大的內分泌器官，其分泌的甲狀腺素是人體生長發育和新陳代謝不可缺少的激素[1]。甲狀腺腫是臨床上常見的甲狀腺疾病，是由于甲狀腺上皮細胞增生而形成的甲狀腺腫大，以頸前喉結兩旁結塊腫大為主要特征，女性顯著高發，高發年齡為20～50歲，嚴重影響了患者的生活和工作[2]。甲狀腺腫大的原因主要有碘攝入不足、甲狀腺腫瘤等甲狀腺疾病誘發、藥物或食物導致甲狀腺激素合成障礙[3]。其臨床治療多采用手術治療，術后長期服用左甲狀腺素鈉，但伴有諸多不良反應，復發率較高。

中醫學認為，甲狀腺腫在中醫學中屬“氣癭”范疇，其多因情志內傷、飲食及水土失宜，以致肝郁日久，氣機不暢，津液凝聚成痰，痰氣交阻，結于頸部而成。傳統中醫藥對該病的治療具有悠久歷史，其治療原則為理氣化痰、軟堅散結、活血化瘀[4]。昆布散為中醫經典方劑，收錄于宋代《圣濟總錄》，由昆布、海藻、松蘿、海蛤、木通、白蘞、桂枝組成，主治氣癭初結，現代臨床常用于治療甲狀腺腫大，療效確切。然而，目前尚缺乏昆布散抗甲狀腺腫大相關藥理實驗研究的科學數據，無法對其臨床推廣及新藥開發提供指導作用。因此，本研究通過建立丙硫氧嘧啶所致大鼠甲狀腺腫大模型，深入探討昆布散對大鼠甲狀腺腫大的治療作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠(180～200 g)72只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005]，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心。飼養溫度24～26 ℃，濕度45%～55%，飲水與飼料充足，適應性喂養7 d。醫學實驗動物環境設施許可證號：SYXK(閩)2019-0007。本研究的動物實驗操作符合動物實驗倫理要求。

1.2 藥物及試劑 昆布散藥液：取處方量昆布30 g、海藻30 g、松蘿10 g、海蛤20 g、木通20 g、白蘞20 g、桂枝20 g，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮實驗所需濃度。丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業有限公司，批號：208936)，使用時以生理鹽水配制為1 mg·mL-1溶液。左甲狀腺素鈉片(德國默克公司，批號：199818)，使用時以生理鹽水配制為2 μg·mL-1溶液。

三碘甲狀腺原氨酸(T3)試劑盒(批號：H222)、甲狀腺素(T4)試劑盒(批號：H223)、促甲狀腺激素(TSH)試劑盒(批號：H087)，均購自南京建成生物工程研究所。Keap1(4678S)、HO-1(43966)、β-actin(3700)，購自美國CST公司；NQO-1(ab28947)、兔二抗、鼠二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器 XY2000C電子天平(常州市幸運電子設備有限公司)、SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司)、Infinite 200 PRO多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)、ChemiDoc XRS+ 化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)、Micro17R臺式高速冷凍離心機(美國賽默飛公司)。

2 方法

2.1 造模方法與分組給藥 除正常對照(Sham)組大鼠外，其余大鼠隨機分為模型組(Model)、左甲狀腺素鈉組(LTS)、昆布散低劑量組(KBS-L)、昆布散中劑量組(KBS-M)、昆布散高劑量組(KBS-H)(n=12)，每天灌服丙硫氧嘧啶溶液(10 mL·kg-1)1次，連續造模14 d。造模成功后，空白組和模型組每天灌服等量的生理鹽水，LTS組按20 μg·kg-1體重灌服左甲狀腺素鈉片溶液，KBS-L、KBS-M、KBS-H組分別按每千體重5.87、11.56、23.14 g生藥灌服昆布散藥液，灌胃體積均為10 mL·kg-1，連續給藥28 d。每周稱重1次，以調整給藥量。

2.2 樣本采集及指標檢測 末次給藥結束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3～5 mL，以3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，采用放射免疫法測定大鼠血清中T3、T4、TSH水平。

處死動物后，迅速取出甲狀腺，電子天平稱濕重，計算甲狀腺系數(甲狀腺系數=甲狀腺重量mg/大鼠體重g×100)。

各組隨機選取6份甲狀腺，根據其重量加入適量預冷的PBS，研磨均勻，制成10%的甲狀腺組織勻漿液，采用比色法測定大鼠甲狀腺組織中MDA、SOD水平。

2.3 Western Blot檢測大鼠甲狀腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達 選取各組剩余6份甲狀腺，稱重后切成碎塊放入勻漿器，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，在冰上充分研磨裂解后，4 ℃離心10 min，上清即為蛋白提取液，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。將制備好的蛋白樣品于100 ℃變性10 min，冷卻至室溫后用SDS-PAGE進行電泳，上樣總量為30 μg。電泳結束后，分別進行轉膜、封閉、孵育一抗、洗滌、孵育二抗，洗滌后用化學發光法檢測各組樣品Keap1、HO-1、NQO-1蛋白條帶，以β-actin為內參，用Image Lab 6.0分析灰度值。

3 結果

3.1 昆布散對大鼠甲狀腺濕重、甲狀腺系數的影響 連續給藥28 d后，與正常組比較，模型組大鼠的甲狀腺濕重和甲狀腺系數明顯增大(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組大鼠的甲狀腺濕重和甲狀腺系數均有所降低，但差異未見顯著統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 昆布散對大鼠甲狀腺濕重、甲狀腺系數的影響

3.2 昆布散對大鼠血清甲狀腺激素水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中T3、T4水平顯著降低(P<0.01)，TSH水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，左甲狀腺素鈉組和昆布散中、高劑量組大鼠血清中T3、T4水平顯著升高(P<0.01)，TSH水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；昆布散低劑量組大鼠血清中各指標均有所改變，但差異未見顯著統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 昆布散對大鼠血清中T3、T4、TSH水平的影響

3.3 昆布散對大鼠甲狀腺組織中SOD、MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中SOD水平明顯下降(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，左甲狀腺素鈉組和昆布散各劑量組SOD水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)(見表3)。

表3 昆布散對大鼠甲狀腺組織MDA、SOD水平的影響

3.4 昆布散對大鼠甲狀腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中Keap1蛋白表達水平顯著增高(P<0.01)，HO-1和NQO-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，昆布散低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織中Keap1蛋白表達水平明顯降低增高(P<0.01)，而HO-1和NQO-1蛋白表達水平則明顯增高(P<0.01)，且呈一定劑量依賴性；左甲狀腺素鈉組則表現出與昆布散各劑量相似的藥理效應(P<0.01)。

Sham：正常組；Model：模型組；LTS：左甲狀腺素鈉組；KBS-L：昆布散低劑量組；KBS-M：昆布散中劑量組；KBS-H：昆布散高劑量組

4 討論

甲狀腺腫大是由于多種原因導致的甲狀腺體積或形態變大，目前以手術和藥物治療為主的治療方式存在諸多不足[5]。甲狀腺的主要功能是合成甲狀腺激素，其中T4、T3具生物學活性，參與調節機體內環境；而TSH參與調節促甲狀腺激素分泌，其水平升高時表示甲狀腺激素分泌不足[6]。本實驗利用丙硫氧嘧啶作為造模藥，其原理是抑制甲狀腺內過氧化物酶系統，阻斷甲狀腺中酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的縮合，從而抑制甲狀腺激素的合成。結果表明，與正常大鼠相比，模型大鼠血清T4、T3水平明顯降低，TSH水平明顯升高；而昆布散治療則顯著上調模型大鼠T4、T3水平，降低TSH水平，表明昆布散可明顯改善甲狀腺腫大大鼠的甲狀腺功能。

當機體發生過度氧化應激損傷時，會生成過多ROS，抗氧化系統不足以及時抗衡，還會導致脂質過氧化，催化裂解產生毒性醛基產物MDA[7]。而SOD是體內的自由基清除劑之一，可有效降低胞內ROS水平，抑制氧化應激反應。本實驗結果顯示，昆布散可明顯上調模型大鼠甲狀腺SOD水平，降低MDA含量，提示昆布散可促進甲狀腺腫大大鼠甲狀腺內氧自由基的清除，并抑制脂質過氧化。研究表明，Keap1/HO-1/NQO-1通路是甲狀腺中氧化應激反應的主要發生途徑之一[8-9]。Keap1敲除后的甲狀腺濾泡細胞系中NQO-1的mRNA表達水平顯著降低[10]；HO-1作為血紅素分解代謝過程中的限速酶，在細胞中發揮抗氧化、抗炎的特性[11]，其下游的NQO-1可參與調節胞質氧化還原狀態，從而發揮維持細胞穩態的作用。本實驗發現，昆布散可明顯降低模型大鼠甲狀腺Keap1蛋白表達，升高HO-1和NQO-1的蛋白表達。綜上，昆布散可能通過抑制甲狀腺腫大大鼠氧化應激反應來改善甲狀腺功能，其機制可能與調控Keap1/HO-1/NQO-1通路有關。