汞中毒模型建立及中藥干預試驗

黃精貴 黃小娟 梅金鈺 黃鷗飛 李文仕

摘要：目的 探討中藥綠豆及其復方海爾福清千口服液對汞中毒小鼠于預效果的實驗研究。方法 用小白鼠復制汞中毒動物模型，然后用中藥灌胃干預，測定各種指標.用氯化汞（HgCl2）注射小鼠腹腔染毒，2周，然后用綠豆水提取液及其復方海爾福清千口服液灌胃干預2周.測定染毒前后及干預后的血紅蛋白含量;實驗結束，取血分離血清測定，處死小鼠，取大腦，制備10%勻漿待測.其余器官肝，腎，生殖器，用甲醛浸泡送病理研究（另文）.結果下面按1綠豆組，2清千組，3模型組，4正常組，依次排列，血紅蛋白（Hb）含量，染毒前：各組間比較，F=1.605，p=0.203，差異無統計學意意義。染毒后：依次排列146.28±19.40▲▲a164.39±13.95▲★a152.26±31.94▲▲c183.63±16.96★★各組間比較，F=6.369，p=0.001，差異有統計學意意義;中藥干預后，依次排列為121.61±13.53▲▲b137.52±15.41▲▲★b145.43±19.17▲▲★★b171.13±17.12★★中藥干預后：各組間比較，F=16.635，p=0.001，差異有統計學意意義;腦（chAT）活力，26.00±8.82★★69.91±35.52★▲78.98±24.89★▲122.42±45.36▲▲：F=8.853，P=0.001，差異有統計學意意義;腦（GSH-PX）活力，142.89±23.38★★126.48±8.11▲113.75±15.82▲▲149.71±22.93★★差異有統計學意意義;腦超氧陰離子自由基（）清除率%，汞中毒明顯下降;結論 綜合分析，汞中毒小鼠，血紅蛋白、體重、大腦部分與記憶相關的關鍵酶活力，均明顯下降;中藥干預后有一定恢復，以海爾福清千口服液更顯著一些。

關鍵詞：汞中毒 ; 小鼠 ; 綠豆; 海爾福清千口服液 ; 干預

【中圖分類號】R995 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）08-014-02

汞在工業上有重要的用途，據報導統計有3000多種，但在工業生產過程中容易造成環境污染，是環境污染主要毒物之一。汞中毒損害機體重要器官，如腎臟，造血系統，生殖系統，神經系統，等[1]。本實驗主要探討汞對記憶有關的關鍵酶活性的影響，以及中藥具有解毒作用的綠豆及其復方制劑對其干預治療作用的探討?，F將結果報導如下。

1. 試劑與方法：

1.1試劑. 乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒、乙酰膽堿轉移酶（chAT）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），測試盒、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒。1-奈胺、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、鹽酸（HCL）、高鐵氰化鉀、氰化鉀、無水磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉，過硫酸銨， 氯化汞，均為國產分析純。

1.2中藥綠豆干品，購自市面，制取流程：稱取中藥放鍋內 加自來水20倍加熱煮沸40分鐘過濾加熱濃縮冷卻 加3倍量v/v95%乙醇沉淀過夜過濾棄沉淀回收乙醇藥液定容裝瓶105℃高壓消毒30 分鐘 . 常溫，保存待用。復方海爾福清千口服液由廣西云球生物科技有限公司研發部提供， 由綠豆、銀花、茯苓、甘草.等組成[2].

1.3動物， 小白鼠40只，昆明種（SPF級），健康，雌雄各半，鼠齡40天平均體重30克。購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司， 物生產許可證號：SCXK（湘）209-0014. 質量檢測單位， 湖南省動檢二站，動物實驗單位：右江民族醫學院，使用許可證號：SYXK桂2011-0010。）.放空氣凈化鼠架裝置內，分籠喂養，每籠6只，雌雄分開，由學院動物室提供用標準飼料喂養，自由飲用自來水。

1.4實驗方法：

用健康小白鼠40只，分成4組，（1）、（2）、（3）為造模組，另設（4）為正常對照組.每組10只.用100mg/dl濃度HgCl2水溶液給小鼠腹腔注射染毒[3]，每日一次，染毒 10 天后， （1綠豆組）、（2清千組）組開始分別用中藥綠豆提取液和海爾福清千口服液（綠豆、銀花、茯苓、甘草復方液）作灌胃干預，以成人量折算， 劑量為0.1mL/只，每日一次，（3模型組）、（4正常對照組）組用等體積的蒸餾水灌胃，連續實驗30日結束.測定染毒前， 染毒后，中藥灌胃干預后血紅蛋白（Hb）. 結束從眼球后取血， ，分離血清， 測定生化指標：血清甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、總蛋白參照文獻說明書測定;處死小鼠，取出大腦，稱重，在冷凍下研磨， 用生理鹽水制備10%腦組織勻漿，離心3000rpm，10min，后取上清液，放冰箱備用。

1.5測定方法

血紅蛋白（Hb）測定采用氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）法，參照文獻[3]。測定腦勻漿乙酰膽堿酯酶（AchE）、乙酰膽堿轉移酶（chAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），活力。Tc用COD-CE-PAP測定;TG用GPO-OAO法測定;尿素氮用脲酶波氏法測定;AchE根據乙酰膽堿在AchE催化下產生乙酸和膽堿，膽堿再與巰基顯色劑作用產生黃色化合物TNB（對稱三硝基苯），比色測定;具體操作按試劑盒說明書;清除率測定利用比色法[6]，其原理： 由A液中三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）與B液中過硫酸銨混合后，產生氧自由基（），經鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、1-奈胺等連續反應， 產生一種黃色產物， 可以比色測定。具體操作參考文獻[4]。乙酰膽堿轉移酶（chAT）測定是以乙酰輔酶A和膽堿為底物，在chAT催化下，反應的生成物與顯色劑結合，在324nm處有吸收峰，以此測定并計算chAT活力. 具體操作按試劑盒說明書。

1.6 統計學處理 用SPSS軟件（13.0版）統計，多組均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗水準為a=0.05。結果用（）表示。

2.結果

2.1一般情況.共用小鼠40只， 雌性 20 只，雄20只，4組每組10只. 綠豆組死亡2只， 模型組死亡2只， 清千組和正常對照組無死亡。

2.2染毒前， 染毒后，中藥灌胃干預后小鼠血紅蛋白（Hb）含量測定結果。 結果顯示，組間比較， 染毒前，小鼠血紅蛋白（Hb） 各組間差異無統計學意義。染毒后，正常組明顯高于其他各組， 差異有統計學意義。中藥干預后， 正常組明顯高于其他各組， 差異有統計學意義。見表1。

方差分析：組間比較;血紅蛋白Hb， 染毒前：各組間比較， F=1.605， p=0.203， 差異無統計學意意義。染毒后： 各組間比較， F=6.369， p=0.001，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01差異有統計學意意義。中藥干預后： 各組間比較， F=16.635， p=0.0010，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差異有統計學意意義。

組內染毒前 、染毒后、中藥干預后（前中后）比較;綠豆組（前中后）比較，F=32.267， p=0.000，與中藥干預后比較，a P<0.01; 與染毒后比較，b P<0.01; 差異有統計學意意義。清千組（前中后）比較，F=26.473， p=0.000，與中藥干預后比較，a P<0.01; 與染毒后比較，b P<0.01; 差異有統計學意意義。模型組（前中后）比較，F=6.208， p=0.006，與染毒前比較，c P<0.05; b P<0.01; 差異有統計學意意義。正常組（前中后）比較，F=2.155， p=0.135，差異無統計學意意義。

2.3腦乙酰膽堿酯酶（AchE），乙酰膽堿轉移酶（chAT）， 腦谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力測定結果. 結果顯示， 腦乙酰膽堿酯酶（AchE）， 組間比較： 差異無統計學意意義; 乙酰膽堿轉移酶（chAT）， 組間比較： 差異有統計學意意義; 腦（GSH-PX）活力， 組間比較： 差異有統計學意意義; 見表2。

方差分析：組間比較： 腦乙酰膽堿酯酶（AchE）活力：F=0.269，P=0.847， 差異無統計學意意義。; 腦（chAT）活力， ：F=8.853，P=0.001， 與正常組比較， ★P<0.05， ★★P<0.01; 差異有統計學意意義; 與綠豆組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01， 差異有統計學意意義; 腦（GSH-PX）活力，與正常組比較， ▲P<0.05， ▲▲P<0.01; 與模型組比較， ★★P<0.01; 差異有統計學意意義;

2.4腦超氧陰離子自由基（）清除率%、血清超氧陰離子自由基（）清除率%，血清總蛋白測定結果. 結果顯示， 腦超氧陰離子自由基（）清除率%、組間比較： 差異有統計學意意義; 血清超氧陰離子自由基（）清除率%， 組間比較： 差異無統計學意意義;，血清總蛋白， 組間比較：，差異有統計學意意義.見表3.

方差分析：組間比較： 腦自由基（）（清除率% ）：F=42.14，P=0.000， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 與清千組比較， ★★P<0.01， 差異有統計學意意義; 血清自由基（）（清除率% ）， 組間比較： F=2.883，P=0.061差異無統計學意意義; 血清總蛋白， F=10.585，P=0.000， 與正常組比較， ★★P<0.01， 差異有統計學意意義;

2.5小鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、尿素氮含量測定結果. 結果顯示，組間比較， 血清甘油三酯，差異有統計學意義; 總膽固醇（TC）， 差異無統計學意義; 尿素氮，差異有統計學意義。見表5 。

方差分析：方差分析：TG， 各組間比較，F=9.474，p=0.000， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 差異有統計學意義; 總膽固醇（TC）， 各組間比較，F=0.449，p=0.685， 差異無統計學意義; 尿素氮， 各組間比較，F=2.742，p=0.056，與清千組比較，★P<0.05， 差異有統計學意義;

2.2染毒前、染毒后、中藥干預后小鼠體重測定結果. 結果顯示， 造模前、治療前，各組間差異無統計學意義， 治療后，各組間比較， 差異有統計學意意義;

方差分析：小鼠體重， 組間比較， 染毒前：各組間比較， F=0.119， p=0.948， 差異無統計學意意義。染毒后， F=6.040，p=0.002， 與組間比較， 與正常組比較，▲▲P<0.01， 差異有統計學意意義; 中藥干預后：各組間比較， F=2.350， p=0.089， 與正常組比較， ▲P<0.05， 差異有統計學意意義;

組內前中后比較， 綠豆組，染毒前， 染毒后， 中藥干預后（前中后）比較， F=3.677， p=0.035，與染毒后比較， aP<0.05， 中藥干預后明顯升高，差異有統計學意意義; 清千組（前中后）比較， F=9.757， p=0.001， 與染毒后比較， b P<0.01， 染毒后明顯下降，中藥干預后明顯升高，差異有統計學意意義; 模型組（前中后）比較， F=0.428 p=0.656，差異無統計學意意義; 正常組（前中后）比較， F=0.700 p=0.505，差異無統計學意意義;

3討論

3.1本次實驗染毒 10 天，綠豆組死亡2只， 模型組死亡2只， 清千組和正常對照組無死亡。

3.2造模后血紅蛋白下降，說明造血系統受到損害。汞對造血系統的抑制作用，主要對血紅素合成過程中關鍵酶的抑制，造成血紅素減少引起貧血[6]。

3.3腦乙酰膽堿酯酶（AchE），乙酰膽堿轉移酶（chAT），是大腦中與記憶有關的關鍵酶，為科學界普遍公認，它們存在于大腦神經細胞中，主要分布在海馬部位和皮層，乙酰膽堿轉移酶催化合成神經遞質乙酰膽堿，而乙酰膽堿酯酶則催化乙酰膽堿分解，它們的活性維持著乙酰膽堿合成與分解的平衡，從而維持著神經傳導正常進行和記憶。本實驗表明，染毒小鼠乙酰膽堿轉移酶活性明顯下降，催化乙酰膽堿合成減少，而乙酰膽堿酯酶活性沒有降低，催化乙酰膽堿分解沒有降低，勢必造成神經遞質乙酰膽堿減少而影響記憶功能[7]。

3.4其他，腦（GSH-PX）活力和腦超氧陰離子自由基（）清除率%、。（GSH-PX）活力是機體清除超氧陰離子自由基（）重要的酶[4]，汞中毒小鼠模型組（GSH-PX）活力明顯降低，低于正常組，表明清除超氧陰離子自由基（）能力下降，而另一實驗指標，超氧陰離子自由基（）清除率%汞中毒組降低則證明了這點。而中藥干預組在模型組與正常組之間，表明清除超氧陰離子自由基（）能力已明顯提升，綠豆組己接近正常組正常組。

3.5其他，從血清尿素氮含量表明，模型組最高，其次是綠豆組，最低是清千組，說明模型組腎臟排泄功能受到一定損害，而清千組保護腎臟排泄功能最好，血清尿素氮含量還低于正常組。體重變化表明，染毒三個組染毒后有降低，正常組沒有變化，中藥干預后有回升，由于后階段己停止染毒，所以模型組體重也緩慢升高，但較慢。正常組體重一直在升高，但由于時間僅30天，沒有太大變化。血清總膽固醇（TC）各組間差異無顯著性，而甘油三酯（TG）正常組明顯高于染毒三個組，血清蛋白染毒組還高正常組，表明汞染毒損害了肝臟對甘油三酯代謝，而對肝臟膽固醇代謝、蛋白代謝尚未損害到，一般認為，肝臟代償能力較大，損害較嚴重時才引起蛋白異常。有關這方面的解釋，還需進一步探討。

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第一作者：黃精貴，女，出生年月：1998年02月。右江民族醫學院2017級藥學本科班學生。通訊作者：李文仕，副主任藥師，E-mail： sqzhang224@163.com