胰蛋白酶制備烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的研究

周勰 葉捷娜 張林佳 黃芳芳 楊最素

摘要 [目的]探討胰蛋白酶制備烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的工藝及體外抗氧化活性。[方法]以烏賊纏卵腺為原料，用胰蛋白酶進行酶解，采用單因素和正交試驗優化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽的提取工藝;將酶解液超濾分成4個分子段，通過體外檢測DPPH清除率、·OH清除率和還原力評價其抗氧化活性。[結果]胰蛋白酶酶解烏賊纏卵腺在加酶量2 000 U/g、pH為8.5、料液比1∶3、酶解時間8 h條件下得到的酶解物對DPPH的清除率最大。酶解液經超濾得到的<3 kD分子段的多肽具有良好的DPPH清除能力、·OH清除能力和還原能力。[結論]胰蛋白酶酶解制備的烏賊纏卵腺多肽具有較好的體外抗氧化活性，可作為抗氧化肽的理想來源。

關鍵詞 烏賊纏卵腺;多肽;胰蛋白酶;酶解;抗氧化活性

中圖分類號 TS 254.9? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）16-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.049?? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Preparation of Antioxidant Activity Polypeptide from Cuttlefish Ovary Gland by Trypsin

ZHOU Xie，YE Jie-na，ZHANG Lin-jia et al （Zhejiang Engineering Research Center for Marine Biomedical Products，School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract [Objective] To explore the conditions for the preparation of antioxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin and study the antioxidant activities of the enzymatic hydrolysates ?in vitro. [Method] The nidamental glands of cuttlefish were used as raw materials and hydrolyzed by trypsin.Single-factor and orthogonal tests were used to optimize the extraction process for anti-oxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish.The enzyme hydrolysate was ultrafiltered into 4 molecular segments，and its antioxidant activity was evaluated by ?in vitro ?detection of DPPH clearance rate，·OH clearance rate and reducing power.[Result] The optimized conditions were as follows： volume of enzyme of 2 000 U/g，pH of 8.5，solid-liquid ratio of 1∶3 and hydrolysis time of 8 h.Peptides with a Mw of less than 3 kD exhibited appreciable antioxidant activities，including DPPH scavenging，·OH scavenging and reducing activities.[Conclusion]The peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin had excellent antioxidant activities ?in vitro ?and could be an ideal source of antioxidant peptides.

Key words Nidamental gland of cuttlefish;Peptides;Trypsin;Enzymatic hydrolysis;Antioxidant activity

人體內自由基的生成和清除一般處于動態平衡狀態，過多的自由基會干擾這種平衡，從而產生氧化應激反應并引起炎癥、糖尿病等疾病[1]?；瘜W合成的抗氧化劑已普遍應用于生物醫學產品、日用化妝品和食品等行業[2]。然而化學合成的抗氧化劑對人體健康有潛在的毒性，因此，開發安全有效的天然抗氧化劑已引起人們的廣泛關注[3]。近年來，越來越多動植物來源的多肽已被證實具有清除自由基的能力[4]，這為開發新型抗氧化劑提供了新的思路。研究表明，通過酶解大分子蛋白得到的抗氧化肽通常具有抗氧化活性強、生物安全性等優勢[5]。海洋蛋白是制備抗氧化活性肽的高質量原料。鮑魚內臟、鯉魚魚鱗等海洋生物蛋白已被報道用于制備具有良好抗氧化活性的多肽[6-7]。

烏賊肉質細膩脆口、營養豐富，且具有很高的醫用價值，備受消費者青睞。但在烏賊加工的過程中，會產生烏賊內臟、烏賊皮、烏賊墨和烏賊骨等大量副產物，近年來研究發現從這些副產物中可以提取大量的具有抗氧化、抗炎等活性的產物[8]。烏賊纏卵腺作為烏賊加工的副產物之一，已被報道用于制備具有抗疲勞、提高免疫功能的生物活性物質[9]。烏賊纏卵腺的舍棄是對蛋白質資源的一種極大耗損。該研究通過單因素和正交試驗優化胰蛋白酶酶解烏賊纏卵腺制備抗氧化肽的工藝，并通過測定DPPH清除率、·OH清除率以及還原力探究不同分子量酶解產物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 新鮮雌烏賊內臟，購自舟山農貿市場。胰蛋白酶（酶活250 U/g），購自北京亞太恒信生物科技有限公司;DPPH、鐵氰化鉀、鄰二氮菲，購自上海晶純試劑有限公司;其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 HWS-24數顯恒溫水浴鍋（山東城創新儀器有限公司）;Cogent u Scale超濾系統（美國密理博公司）;pHS-250 pH計（上海理達儀器廠）;UV-1600PC紫外分光光度計（上海美譜達解儀器有限公司）;CF16RN高速冷凍離心機（日立儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 烏賊纏卵腺抗氧化活性肽制備工藝。取烏賊纏卵腺，去除周圍其他組織，搗碎成勻漿液→調料液比→調pH→胰蛋白酶酶解（37 ℃）→滅酶活（沸水浴10 min）→離心（12 000 r/min，15 min）→取上清液→冷凍干燥。

1.3.2 單因素試驗。該試驗以加酶量（1 000、1 500、2 000和2 500 U/g）、pH（7.5、8.0、8.5和9.0）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3和1∶4）和酶解時間（2、4、6和8 h）為影響因素進行單因素試驗，以游離氨基氮（ANN）含量為指標，來確定胰蛋白酶酶解的條件范圍。該試驗除被考察的單因素外，其他3因素均為相同的固定值（加酶量為1 500 U/g、pH為8.0、料液比為1∶3、酶解時間為8 h）。ANN含量與水解度呈正相關。ANN含量用甲醛電位滴定法測定[10]。

1.3.3 正交試驗優化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽提取工藝。根據單因素試驗結果，考慮到pH、時間、加酶量、料液比4個因素，選取L 9（34）正交試驗記錄表，以DPPH清除率評價酶解液的抗氧化活性。因素和水平見表1。

1.3.4 超濾截留。取冷凍干燥的烏賊纏卵腺酶解液，用超濾系統進行超濾分段，得到4個不同分子段的提取液，分別為<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。將各分子段的超濾液進行冷凍干燥，測定其體外抗氧化活性。

1.3.5 體外抗氧化能力的測定。DPPH清除率[11]、·OH清除率[12]、還原力[13]的檢測參照文獻進行并適當改進。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 加酶量對烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖1可以看出，隨著胰蛋白酶添加量的持續增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在加酶量為2 000 U/g時，ANN含量到達最高值。當加入少量胰蛋白酶時，底物會和胰蛋白酶充分結合，加酶量越大，底物水解越充分。但當胰蛋白酶超過一定量后，過多的酶分子會抑制中間產物轉化成終產物[10]。因此選擇加酶量1 500、2 000、2 500 U/g進行后續正交試驗。

2.1.2 pH對烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖2可以看出，隨pH的增加，酶解物的ANN含量先增加后降低。胰蛋白酶的pH過高或過低都會導致酶活性降低，從而影響底物的水解[14]。因此選擇pH為7.5、8.0、8.5進行后續正交試驗。

2.1.3 料液比對烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖3可以看出，當料液比持續增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在料液比為1∶3時，酶解物的ANN含量到達最高值。這可能是因為酶解過程中較小的料液比使底物濃度降低，從而導致酶促反應的速度降低，酶解產物減少。因此選擇料液比為1∶1、1∶2、1∶3進行后續正交試驗。

2.1.4 酶解時間對烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖4可以看出，酶解時間越長，酶解物的ANN含量越高。當酶解時間為8 h時，酶解物的ANN含量最高。所以選擇酶解時間為4、6、8 h進行后續正交試驗。

2.2 正交試驗 為進一步優化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽的制備工藝，進行了正交試驗，結果見表2。從表2可以看出，影響胰蛋白酶酶解產物DPPH清除率的各因素排序為D>A>C>B，即酶解時間>加酶量>料液比>pH，其中酶解時間的影響最大，pH的影響最小。在組合為A 2B 3C 3D 3即加酶量為2 000 U/g、pH為8.5、料液比為1∶3、酶解時間為8 h時，酶解物的DPPH清除率最高。

2.3 超濾截留 通過超濾將烏賊纏卵腺的酶解物分為分子量<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD的多肽，其抗氧化能力如圖5所示。與其他超濾組分相比，<3 kD的組分具有最高的DPPH清除率、·OH清除率和還原力。研究表明，低分子量的蛋白質水解產物具有較強的抗氧化活性[15]。因此，選擇分子量<3 kD的組分用于后續抗氧化活性的評估。

2.4 抗氧化活性的評估

2.4.1 DPPH清除率的測定。由圖6可知，<3 kD分子段多肽隨著其濃度的升高，DPPH清除率也升高;當多肽濃度為16 mg/mL時，清除率達到最大，最大清除率為90.95%。而陽性對照抗壞血酸（V C）的DPPH清除率都在95%～100%。所以<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽具有良好的DPPH清除能力。

2.4.2 ·OH清除率的測定。由圖7可知，陽性對照V C組隨濃度的增加，其對·OH的清除率增加，增加幅度較大;當V C濃度為16 mg/mL時，·OH清除率最大達到84.07%。<3 kD 分子段多肽隨濃度的增加，·OH清除率也呈上升趨勢，在多肽濃度為16 mg/mL時達到最大清除率63.61%，但其增加幅度較陽性對照組低。因此<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽具有較好的·OH清除率。

2.4.3 還原力的測定。由圖8可知，<3 kD分子段多肽隨著濃度的升高，其還原力值逐漸升高。在濃度為16 mg/mL時，還原力達到最大值（0.284）。但同等濃度下的抗壞血酸的還原能力要強于<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽的能力。因此<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽有較好的還原能力。

3 結論

該試驗結合單因素和正交試驗篩選出胰蛋白酶提取烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的最優條件：加酶量為2 000 U/g，pH為8.5，料液比為1∶3，酶解時間為8 h。酶解液通過超濾得到4個不同分子段，分別為<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。通過檢測DPPH清除率、·OH清除率和還原力，發現<3 kD分子段多肽具有最佳的抗氧化活性。該研究結果表明烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，在生物醫學、日用化妝品和食品行業有一定的開發利用價值。

參考文獻

[1] SILA A，BOUGATEF A.Antioxidant peptides from marine by-products：Isolation，identification and application in food systems.A review[J].Journal of functional foods，2016，21：10-26.

[2] PAN X，ZHAO Y Q，HU F Y，et al.Preparation and identification of antioxidant peptides from protein hydrolysate of skate （ Raja porosa） ?cartilage[J].Journal of functional foods，2016，25：220-230.

[3] BOUGATEF A，HAJJI M，BALTI R，et al.Antioxidant and free radical-sca-

venging activities of smooth hound （ Mustelus mustelus） ?muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases[J].Food chemistry，2009，114（4）：1198-1205.

[4] 張昊，任發政.天然抗氧化肽的研究進展[J].食品科學，2008，29（4）：443-447.

[5] SARMADI B H，ISMAIL A.Antioxidative peptides from food proteins： A review[J].Peptides，2010，31（10）：1949-1956.

[6] 田裕心，彭亞博，姚昱錕，等.響應面優化鮑魚內臟抗氧化肽制備工藝及其活性[J].食品工業，2019，40（4）：110-115.

[7] 李美娜，黎德佳，謝景，等.鯉魚魚鱗蛋白的酶解制備工藝及其抗氧化活性[J].安徽農業科學，2017，45（19）：86-89.

[8] 宋正規，雷靜，薛張芝，等.烏賊皮膠原蛋白特性與抗氧化能力研究[J].天然產物研究與開發，2018，30（2）：286-293.

[9] 劉倩茹，柏圣達，趙國雨，等.北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的制備[J].湖北農業科學，2018，57（13）：70-74，78.

[10] 顏琳，姜雙雙，閆欣，等.皺紋盤鮑腹足抗氧化肽的制備及其工藝優化[J].食品與發酵工業，2019，45（17）：123-128.

[11] 曾健輝，朱寶君，王娟，等.響應面法優化酶解海洋低值魚肉制備抗氧化肽工藝[J].安徽農業科學，2016，44（22）：80-83.

[12] 李世博.鏡鯉（ Cyprinus carpio） 魚皮抗氧化膠原蛋白肽的制備和性質研究[D].哈爾濱：黑龍江大學，2013.

[13] YE H，ZHOU C H，SUN Y，et al.Antioxidant activities ?in vitro ?of ethanol extract from brown seaweed ?Sargassum pallidum [J].European food research and technology，2009，230（1）：101-109.

[14] 劉建偉，梁文文，熊善柏，等.響應面法優化鰱魚皮抗氧化肽的混合酶解工藝[J].食品工業，2018，39（3）：157-161.

[15] LI Y，LI J，LIN S J，et al.Preparation of antioxidant peptide by microwave-assisted hydrolysis of collagen and its protective effect against H 2O 2-induced damage of RAW264.7 cells[J].Marine drugs，2019，17（11）：1-13.