基于提高乙醇產率的常壓室溫等離子體微藻誘變育種

孫 哲,孫 昕,李鵬飛,劉明文,李 盟,張清宇 (西安建筑科技大學環境與市政工程學院,陜西 西安 710055)

傳統化石能源的持續消耗引發了能源危機,帶來了溫室效應、霧霾等問題,開發可再生的替代能源迫在眉睫[1].乙醇作為一種辛烷值高達115且可再生的綠色清潔燃料受到廣泛關注[2].微藻作為第三代生物質能源,分布廣泛、生長速度快、不占用耕地,細胞中含有較多的可溶性多糖,藻類所含的纖維素相對陸生植物而言氫鍵更弱,更易于預處理,是制備生物乙醇的良好原料[3].

利用微藻制備乙醇主要依靠藻細胞內碳水化合物,獲取高含碳水化合物的藻株對制備生物乙醇具有重要意義.由于藻細胞內碳水化合物是最直接的供能物質,而碳水化合物的積累通常發生在對細胞生長不利的環境下,這一定程度上限制了微藻生物量的積累,對選育優勢藻株帶來了阻礙[4].目前常用的是對藻類進行氮、磷脅迫使藻細胞內淀粉含量增加[5],但會以減少生物量作為代價[6].

常壓室溫等離子體(ARTP)是一種安全高效的新型誘變裝置,通過改變細胞理化特性引起組織損傷,迫使細胞啟動SOS修復機制,進而改變生物細胞內遺傳物質[7-8].相比于紫外線、射線、激光等誘變方法,ARTP輻射均勻,突變率高并具有多樣性[9],同時該方法操作簡單,工作溫度低(＜40℃),安全系數高,不涉及有毒有害物質,比化學誘變更加環保[10].

誘變育種目前在微藻領域已經得到廣泛應用,包括提高藻細胞生長速率[11]、油脂含量[12-13]、光和活性[14]以及氨基酸產量[15]等,特別是在提高細胞油脂含量方面的應用較多,然而有關利用誘變提高藻細胞碳水化合物的報道較少[16].相關研究已經證實ARTP在提高藻細胞多糖以及胞外聚合物(EPS)方面取得了一定的效果.Liu等[17]利用 ARTP誘變寇氏隱甲藻葡萄糖含量提高了 57.17%,但最終含量僅達到9.4%.Fang等[18]最先利用ARTP誘變鈍頂螺旋藻,獲得碳水化合物占比 33.1%的藻株,但未驗證藻株實際發酵性能,并且發現 ARTP更適用于單細胞微生物,然而鈍頂螺旋藻是一種多細胞微生物,且難以實現單細胞的分離.

小球藻屬于綠藻,具有高質子效率,能夠合成大量碳水化合物并將其轉化為生物乙醇[19].本研究以普通小球藻為研究對象,在不同功率條件下利用ARTP對小球藻進行輻射,篩選出碳水化合物含量高、生長速率快的優勢藻株,并進行生物乙醇制備實驗,旨在為制備生物乙醇提供優勢原材料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藻株 實驗藻株為普通小球藻,購于中國科學院武漢水生生物研究所,編號為FACHB-25.

1.1.2 實驗試劑 無水乙醇、甘油、三氯甲烷、濃硫酸、苯酚、甲醇、丙酮、BG11培養基配制試劑等,以上試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 等離子體誘變 將小球藻培養至對數生長期備用.ARTP裝置預熱 30min,誘變平臺距輻射口5mm,進氣量為300L/h,電流為1.0A,時間為40s,功率依次為0,20,40,60,80,100,120,140,160W,其中0W為對照.

每次取 0.1mL藻液進行輻射處理,然后轉移到10mL含有 5%甘油的培養基中避光放置數小時,以防止光修復[20-21].稀釋100倍后取0.1mL置于瓊脂固體培養基進行平板涂布.根據固體培養基上長出的藻落個數計算不同功率條件下的致死率[4].致死率計算公式如下:

式中:B為誘變后在固體培養基上長出的藻株數; C為對照組長出的藻株數.

1.2.2 誘變后小球藻的篩選 在固體培養基上進行初次篩選時,選取藻落大(生長快)、相對獨立(純度高)的藻株,用接種環取出后進行孔板擴培,同時以未處理的藻落作為對照.培養 2周左右,測定各藻株的OD680和多糖產量,選出生長速率或多糖產量高于原始藻株 20%以上的藻株,將篩選后的藻株多次傳代培養,以保證藻株的遺傳穩定性.

1.2.3 生長曲線與生物量測定 將各藻株在波長680nm處以相同吸光度接種于 250mL錐形瓶中擴培,每天在同一時刻測量各藻株的 OD 值,繪制生長曲線.生物量測定方法采用差重法[22],利用下式計算生物量.

式中:B為生物量,g/L;M1為濾膜烘干后質量,g;M2為藻液烘干后濾膜質量,g;V 為藻液體積,L.

1.2.4 藻細胞組分測定 總糖測量方法采用苯酚-硫酸法[23],在 490nm 吸光度下檢測波長,帶入葡萄糖標準曲線計算總糖產量以及產率(單位時間、單位體積的藻液中總糖增加的質量).淀粉含量的測定采用Solarbio淀粉含量檢測試劑盒.脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定[24].蛋白質含量采用Bradford法測定[25].

1.2.5 葉綠素熒光及葉綠素含量測定 利用調制葉綠素成像系統評價微藻光合性能.在藻細胞對數生長期設定相關參數,Meas.Light為3, Act.Light為4,Ext.Ligh為3,Sat.Pluse為5,Gain為1.葉綠素的提取采用 De Souza[4]的方法,在 653nm、666nm、750nm處測量上清液吸光度,帶入下式計算葉綠素含量.

1.2.6 藻細胞干重中元素占比測定 利用穩定同位素比質譜儀測定不同藻株干重細胞中 C、N、P元素占細胞干重百分比[26].

1.2.7 微藻發酵方法 在培養末期,通過離心、冷凍干燥將藻液制成藻粉,分別取10g藻粉,根據Chai等[18]的方法,利用5%(V/V)硫酸進行預處理,利用α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶進行糖化.

采用同步糖化發酵(SSF)工藝,發酵參數參考Dahnum 等[27],料液比為 1:10,發酵過程在水浴鍋中進行,恒溫 30℃,持續 84h.發酵罐中按 1:20(g/mL)加入酵母細胞和釀酒酵母,同時添加酵母菌生存所需要的營養物質,包括酵母提取物、KH2PO4和NH4Cl等[19].

1.2.8 乙醇得率計算方法 乙醇濃度測定采用氣相色譜法[19],乙醇得率和單位體積藻液可獲得乙醇產量根據下式計算:

式中:Y為乙醇產量,g/10gDW;CEtOH為測得的乙醇濃度,×10-6;ρEtOH為乙醇密度,0.789g/cm3;V為發酵液體積,mL.

式中:YL為單位體積藻液可獲得乙醇產量,g/L; Y為乙醇產量,g/10gDW;DW 為單位體積微藻生物量,mg/L.

2 結果與分析

2.1 誘變功率條件確定

根據1.2.1誘變方法,在不同功率下進行輻射并計算致死率.圖1表明,致死率隨功率的增加而提高,當功率升至 100,120,140,160W 時,致死率分別達到92.13%,96.52%,99.34%,100%.根據現代育種理論,致死率在 95%以上獲得正向突變株(高產多糖藻株)幾率最大[10],同時為了保證誘變藻株的生存能力,最終確定功率條件為100W和120W.

圖1 不同功率下小球藻致死率對比Fig.1 Comparison of the lethality rate of Chlorella under different power

2.2 不同藻株生長曲線與多糖對比

不同藻株生長曲線對比如圖 2所示.其中S120-9藻株在對數生長期內生長迅速,在 25d時生物量達到820mg/L,相對于原始藻株的700mg/L提高了17.14%;S100-7藻株前期OD值高于原始藻株,隨后速率變緩,25d時OD值已經低于原始藻株,生物量僅有 600mg/L.而 S120-4藻細胞在增殖分裂方面受到了抑制,生長曲線增長緩慢,末期生物量僅500mg/L,這很可能是細胞以生物量為代價應對外界環境的一種保護機制,從而更好地抵抗逆境.

圖2 不同藻株生長曲線對比Fig.2 Comparison of growth curves of different algae strains

圖3為不同藻株多糖產量對比.前期各藻株多糖產量相近,一方面該階段各藻株的生物量差異不明顯,另一方面是進入對數生長期,細胞增殖分裂比較旺盛,消耗細胞內較多營養物質,多糖得不到有效積累.隨著藻株不斷生長，25d時,各藻株多糖產量達到峰值,其中S120-9藻株多糖產量達到237.98mg/L,是原始藻株多糖產量的1.34倍.

圖3 不同藻株多糖產量對比Fig.3 Comparison of polysaccharide yield of different algae strains

不同藻株多糖含量及多糖產率對比如圖 4所示.S100-7、S120-4藻株多糖含量分別達到34.64%、37.55%,相對于原始藻株分別提高了 32.37%、43.48%.S120-9藻株產率最高為10.09mg/(L·d),其次是 S100-7藻株的 9.18mg/(L·d),較原始藻株的 7.44 mg/(L·d)均有所提高.

圖4 不同藻株多糖含量及產率對比Fig.4 Comparison of polysaccharide content and yield of different algae strains

2.3 不同藻株光合性能比較

葉綠素對于藻類的光合作用進程起到至關重要的作用[28],微藻吸收的光能除了光化學反應外,部分光能也會以熒光形式釋放,利用葉綠素熒光衡量不同藻株對光能的吸收利用情況[29].

通過圖5(a)可以發現S120-9藻株的Y(Ⅱ)值較高,開放的 PSⅡ反應中心捕獲光能并用于光化學反應[20],較高的光合作用效率有助于藻細胞生長代謝,為生物量獲取打下基礎,同時也加快了碳水化合物的合成.而S120-4藻株實際光合作用效率較弱,這也使得該藻株生物量有所減少.

圖5 不同藻株光合參數對比Fig.5 Comparison of photosynthetic parameters of different algae strains

圖 5(b)中 S100-7、S120-9兩株藻的表觀電子傳遞速率(ETR)較原始藻株得到提高,由此經過光反應得到更多的 ATP和 NADPH,后者驅動 Calvin—Benson—basham 循環在暗相產生碳水化合物[30].Gupta等[31]發現微藻細胞通過氧化磷酸化進一步分解細胞內葡萄糖,生成ATP用于細胞分裂,這也解釋了藻株進入對數生長期后多糖含量增加不明顯但生物量快速增加的原因.圖 5(c)為不同藻株的葉綠素含量對比,S100-7、S120-9藻株的葉綠素a、葉綠素 b含量較原始藻株有所提高,這有利于加強光能轉化為化學能,從而加快葡萄糖、淀粉等碳水化合物合成.

2.4 不同藻株細胞組分含量分析

藻細胞代謝過程中,淀粉和脂類的合成過程中有相同的 C3前體[32],首先積累淀粉顆粒,然后積累含有三酰甘油酯的脂質體,其代謝過程高度相關[33].圖 6為各藻株細胞組分含量對比情況,篩選藻株的淀粉含量均有所增加,特別是S120-4藻株淀粉含量達到24.04%,比原始藻株提高了41.66%.同時發現篩選藻株的油脂含量有所降低,這表明細胞在吸收利用的碳源更多的流向合成淀粉的方向.蛋白質的含量與細胞分裂有密切聯系[34],各藻株的蛋白質含量差異不大,但S120-4藻株略有減少,這也一定程度上導致該藻株生物量較少.

圖6 不同藻細胞組分含量對比Fig.6 Comparison of the content of different algae cell components

C的吸收利用與細胞內淀粉、油脂等儲能物質的合成息息相關;N有助于微藻生物量生產和能量傳輸,是藻細胞中蛋白質、酶以及葉綠素在內重要元素[35];P參與ATP的合成,在藻細胞能量循環中充當重要角色[36].各藻細胞干重中元素占比情況如圖 7所示.S120-4藻株中C增加最為明顯,高達47.57%,這與其較高碳水化合物含量相一致.N含量對比中,S120-4藻株最少僅有 3.75%,因此該藻細胞內蛋白質以及葉綠素較少.S100-7、S120-9藻株P比例分別為 0.51%、0.56%,較原始藻株的 0.49%有所提高,這也解釋了這兩株藻對數期生長較快的原因.

圖7 不同藻細胞干重中C、N、P元素占比Fig.7 The proportion of C, N, P in the dry weight of different algae cells

2.5 不同藻株形態差異對比

從表 1可以看出原始藻株 90%的細胞粒徑在7nm 以下,3～11nm 范圍內包含了 99.36%的藻細胞,普通小球藻細胞粒徑一般在 3～8nm范圍內.S100-7藻株粒徑則整體偏大,7nm以下的在細胞僅占52.28%,11nm 以下的藻細胞也只占到 73.23%,這表明 ARTP誘變對細胞形態產生了較大影響,一方面可能是影響細胞的分裂增殖,改善了細胞增殖分裂能力,另一方面就是改變了單個細胞的形態大小.S120-4與 S120-9細胞粒徑分布比例較為相近,7nm 以下比例分別為 55.65%和 65.37%,粒徑在15nm以下的藻細胞分別占比為 94.75%和 96.34%,藻細胞粒徑整體要大于原始藻株.通過圖 8的電鏡圖片可以對比藻細胞形態變化,相比于原始藻株(a),S100-7(b)藻細胞更加飽滿,S120-4(c)和 S120-9(d)表面則相對粗糙一些,這部分可能是藻細胞產生的胞外聚合物.

表1 不同藻株粒徑分布Table 1 Particle size distribution of different algae strains

圖8 掃描電鏡下各藻株形態對比Fig.8 Morphological comparison of different algae under scanning electron microscope

2.6 不同藻株乙醇產量分析

圖9為各藻株制備乙醇情況對比.經過84h的發酵過程,原始藻株、S100-7、S120-4、S120-9四株藻每10g藻粉得到生物乙醇產量分別為1.12、1.41、1.58、1.26g,多糖含量最高的S120-4藻株乙醇制備量最高,是原始藻株的1.41倍.

圖9 不同藻株乙醇產量以及生物量對比Fig.9 Comparisons of ethanol production and biomass of different algae strains

由于 S120-4藻株在培養周期內生物量積累受限,因此結合各藻株培養階段生物量積累情況,最終推算出原始藻株、S100-7、S120-4、S120-9單位體積藻液乙醇產量分別為 0.0784、0.0846、0.079、0.1033g/L.綜合比較而言,S120-9藻株在制備乙醇方面具有顯著的優勢,是經過 ARTP誘變篩選后取得的優勢藻株.

3 結論

3.1 利用ARTP在功率100W和120W條件下輻射小球藻 FACHB-25,篩選出了較為理想的誘變藻株,其中S120-4藻株碳水化合物含量達到37.55%,提高了 43.48%; S120-9藻株生物量達到 820mg/L,多糖產量是原始藻株 1.34倍.目前各藻株相關數據均在實驗室內完成,需要后續在大規模微藻培養過程中得到各藻株性能的進一步驗證.

3.2 藻株的篩選必須在生物量和碳水化合物含量之間做好權衡.S120-4藻株在相同干重下,乙醇產量是原始藻株的 1.41倍,就提高藻細胞碳水化合物含量而言,S120-4藻株是篩選出的優勢藻株.但藻細胞內碳水化合物積累越多,生物量限制越明顯.結合各藻株生物量,推算出理論上乙醇產量最多的是S120-9藻株,為0.1033g/L,具有較好的應用前景.