鴨坦布蘇病毒甲基轉移酶的真核表達及鑒定

韓凱凱 嚴若峰 劉青濤 劉宇卓 李銀 趙冬敏 黃欣梅 楊婧

摘要：甲基轉移酶（methyltransferase，MTase）是鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）非結構蛋白5的重要功能基團，在病毒復制及致病過程中發揮重要作用。為了對鴨坦布蘇病毒甲基轉移酶進行真核表達，并對其生物學功能進行鑒定，以GenBank中收錄的DTMUV JS804株基因序列為模板，設計針對MTase的特異性引物，提取TMUV RNA，反轉錄得到cDNA，以其為模板進行擴增，得到MTase的基因片段，然后亞克隆至pCMV-Flag真核表達載體中，構建重組質粒pCMV-Flag-MTase，提取去除內毒素的重組質粒，并轉染至BHK-21細胞，通過間接免疫熒光觀察和Western Blot鑒定該蛋白的表達。結果顯示，質粒pCMV-Flag-MTase經雙酶切鑒定證明構建正確，通過間接免疫熒光與Western Blot檢測，重組質粒在BHK-21細胞內正常表達，表達的蛋白與天然坦布蘇病毒MTase具有相同的反應原性。

關鍵詞：鴨坦布蘇病毒;甲基轉移酶;真核表達

中圖分類號：S852.65+7?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0147-03

收稿日期：2020-12-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：31502101）;江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（20）3093]。

作者簡介：韓凱凱（1983—），男，河南新鄉人，博士，副研究員，主要從事水禽疫病防控相關研究。E-mal：hankk0917@126.com。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，通過節肢動物的叮咬進行傳播而導致宿主發病，主要引起20日齡以內的雛鴨出現嚴重的神經癥狀，死淘率增高及產蛋鴨的產蛋大幅下降[1]。坦布蘇病毒基因組是單股正鏈RNA，含有一個大型開放閱讀框，可編碼7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）和3種結構蛋白（C、PM和E）[2]。NS5在這幾種蛋白中分子量是最大的，大約100 ku，整個NS5蛋白具有2個功能域，分別是N端的甲基轉移酶結構域和C端的RNA依賴的聚合酶結構域。NS5蛋白甲基轉移酶功能基團同時具有N-7和2′-O這2種甲基化功能，可以催化病毒遺傳物質RNA的5′端形成一型的RNA帽子[3]，這一帽子結構對病毒具有重要作用，可以防止病毒遺傳物質被宿主細胞內的核酸外切酶降解，輔助病毒完成免疫逃逸。

目前，在黃病毒屬其他病毒，如登革病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、寨卡病毒上均有甲基轉移酶的相關報導[4-5]，但在鴨坦布蘇病毒上卻鮮有研究。本研究構建了鴨坦布蘇病毒甲基轉移酶基因的真核表達系統，并在哺乳動物細胞中高效表達MTase重組蛋白，旨在為進一步研究其功能、研發坦布蘇病毒病的診斷、治療方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和載體

坦布蘇病毒分離株（JS804）、BHK-21細胞株、真核表達載體pCMV-Flag，均由筆者所在實驗室保存。E.coli DH5α感受態細胞，購于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、蛋白質相對分子質量標準等，購自寶生物工程（大連）有限公司;體液病毒RNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒，購自Axygen生物科技有限公司;脂質體轉染試劑lipofectamine 3000，購自Invitrogen公司;FITC標記的山羊抗小鼠IgG，購于碧云天公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG，購于中杉金橋公司;DMEM細胞培養基、胎牛血清，購自Gibco公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的坦布蘇病毒JS804株（GenBank登錄號JF895923） NS5基因序列，設計PCR 擴增引物，其中上游引物為MTase-F：5′-CAGGGACCCTCGAGATGGGAGGGGGAACT-3′，劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點。下游引物為MTase-R：5′-CCAAGTCTTCCGCGGATTGTCTTGGTCAT-3′，劃線部分為引入的SacⅡ酶切位點。以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，預期擴增片段大小為900 bp。

1.4 DTMUV MTase基因的擴增

按照Axygen公司體液病毒RNA提取試劑盒要求提取DTMUV JS804株的總RNA，并按照反轉錄試劑盒操作說明書，合成反轉錄產物cDNA。以cDNA為模板，MTase-F和MTase-R為引物進行PCR擴增。擴增體系（25.0 μL體系）：其中雙蒸水15.0 μL，10×Ex PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物（25.0 pmol/μL）各1.0 μL，cDNA產物1.5 μL，Ex Taq （5 U/μL） 0.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30 次循環;72 ℃總延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確后按照瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒操作說明進行產物回收純化?；厥盏钠伟凑誴MD19-T載體說明書進行連接，構建重組克隆質粒，并轉化至DH5α感受態細胞中，經LB固體培養基37 ℃倒置過夜培養后，挑取單菌落振蕩培養3 h，并對菌液進行PCR鑒定。鑒定正確的菌液取500 μL送至南京生工生物科技有限公司進一步測序，鑒定正確后按照質粒提取試劑盒操作說明提取質粒。

1.5 重組質粒pCMV-Flag-MTase的構建

用XhoⅠ、SacⅡ對重組克隆質粒及pCMV-Flag載體雙酶切，電泳切膠回收，將2種酶切后回收的片段按照適宜比例與T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜。連接產物轉化至DH5α 感受態細胞中，涂布于卡那霉素的平板，37 ℃倒置過夜培養，挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，鑒定正確的菌液擴大培養后提取質粒，用XhoⅠ、SacⅡ進行雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送至南京擎科生物科技有限公司測序，鑒定正確的重組質粒命名為pCMV-Flag-MTase。

1.6 BHK-21細胞的轉染

按照質粒小量提取試劑盒要求提取pCMV-Flag-MTase，分光光度計測定其濃度。取處于對數生長期的BHK-21細胞，接種24孔細胞培養板，細胞鋪至細胞板約90%時進行轉染。按照lipofectamine 3000轉染試劑操作說明書制備DNA-脂質體混合物，其中轉染的DNA用量為2.5 μg?；靹蚝笫覝胤跤?0 min，將DNA-脂質體混合物均勻鋪到細胞中。

1.7 間接免疫熒光鑒定

取質粒pCMV-Flag-MTase轉染24 h后的BHK-21細胞，PBS洗滌3次，采用4%多聚甲醛固定細胞10 min;PBS洗滌3次，每次5 min，采用0.5% triton X-100對細胞透化處理10 min;PBS洗滌3次，5 min/次，加入1% BSA，室溫封閉30 min;PBS洗滌3次，5 min/次，然后加入事先制備的坦布蘇病毒陽性小鼠血清（1 ∶1 000），室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次，最后加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG（1 ∶400），室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，5 min/次，倒置熒光顯微鏡下觀察，照相記錄。

1.8 Western Blot鑒定

pCMV-Flag及pCMV-Flag-MTase分別轉染BHK-21細胞，48 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后經Western Blot檢測該蛋白的表達情況。先進行SDS-PAGE電泳，再經轉膜、封閉，然后以抗坦布蘇病毒陽性小鼠血清體為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG為二抗進行反應，ECL顯影觀察結果。

2 結果與分析

2.1 鴨坦布蘇病毒MTase基因的PCR擴增

由圖1可知，以含有鴨坦布蘇病毒JS804株全長基因的cDNA為模板，采用所設計的特異性引物擴增MTase基因全長，結果擴增的片段大小約為900 bp，與預期片段大小相符。

2.2 重組質粒pCMV-Flag-MTase的PCR和雙酶切鑒定

由圖2可知，菌液PCR結果顯示，挑取的單克隆均為陽性，可擴增得到與MTase大小一致的DNA片段。利用XhoⅠ、SacⅡ對重組質粒pCMV-Flag-MTase進行雙酶切，結果顯示出現2條特異性的條帶，一條大小約為4 300 bp，為pCMV-Flag載體條帶，另一條大小為900 bp，與MTase大小一致。測序結果顯示，MTase基因序列與GenBank發布的序列同源性達99%。結果表明真核質粒pCMV-Flag-MTase構建成功。

2.3 重組質粒pCMV-Flag-MTase的轉染效果

采用脂質體轉染試劑lipofectamine 3000介導pCMV-Flag-MTase轉染至BHK-21細胞，24 h固定間接免疫熒光檢測表達情況。通過倒置熒光顯微鏡觀察，由圖3可知，正常未轉染細胞無綠色熒光，而重組質粒轉染細胞能觀測到綠色熒光，熒光多數位于細胞質中，表明重組質粒pCMV-Flag-MTase能成功轉染至BHK-21細胞中，其轉染效率未受外源插入蛋白的影響。

2.4 DTMUV MTase在BHK-21細胞中的表達

由圖4可知，經Western Blot檢驗，重組DTMUV MTase蛋白與坦布蘇病毒陽性小鼠血清能發生特異性結合，條帶分子量大小約30 ku，表明重組DTMUV MTase蛋白具有免疫反應活性。

3 討論

鴨坦布蘇病毒作為黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群的重要成員，自2010年4月來，該病迅速傳播到我國絕大部分養鴨地區，不僅給養鴨業帶來了很大經濟損失，而且極大地影響和制約了我國養鴨業乃至畜牧業的穩定健康發展[2]。因此，除了快速研制針對性的疫苗外，深入探索坦布蘇病毒致病性、病毒蛋白質的結構功能及快速簡便的臨床檢測方法，也成為現階段防控坦布蘇病毒病發生的重要技術手段。

NS5蛋白是坦布蘇病毒基因組編碼最大的蛋白質，蛋白質分子量可達100 ku，是黃病毒中最為保守的蛋白。而坦布蘇病毒NS5蛋白的N端前900 bp為甲基轉移酶活性的主要活性區，同時具有N-7和2′-O這2種甲基轉移酶活性且對RNA序列有依賴性，參與病毒基因組RNA復制。有研究發現，當MTase的甲基化位點發生突變時，其病毒復制的能力將顯著降低[6]。同時，MTase蛋白對宿主抗病毒反應也有拮抗作用，西尼羅病毒MTase蛋白的 2′-O甲基化功能區可以下調一種干擾素誘導產生蛋白的表達，進而使病毒逃避宿主的天然免疫反應，具體作用機制和生物學反應過程迄今尚不明確[7]。鑒于此，MTase作為DTMUV的主要蛋白酶，與其他非結構蛋白共同作為病毒基因組復制和轉錄的承載體，負責蛋白翻譯后的切割、修飾等重要過程，在DTMUV病毒粒子成熟和復制過程中承擔重要角色。又由于MTase在黃病毒屬病毒中具有高度保守的氨基酸序列[7]，因此可以作為研究抗坦布蘇病毒相關藥物和疫苗的關鍵靶標。目前，關于坦布蘇病毒MTase蛋白相關研究較少，本研究通過克隆DTMUV MTase蛋白編碼基因，并成功克隆至pCMV-Flag真核表達載體，通過間接免疫熒光和Western Blot試驗檢測，發現MTase蛋白表達成功。本研究獲得的重組坦布蘇病毒MTase蛋白可作為包被抗原，建立ELISA方法來檢測血清中的抗體水平，亦可以用來篩選具備診斷功能/中和活性的單克隆抗體，此外，還為研究坦布蘇病毒的感染致病機制提供了基礎。

參考文獻：

[1]吳 雙，姜 勇，徐建生，等. 鴨坦布蘇病毒、鴨腸炎病毒和番鴨細小病毒TaqMan三重實時熒光定量PCR檢測方法的建立與臨床應用[J]. 江蘇農業學報，2020，36（3）：626-633.

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[3]Egloff M P，Benarroch D，Selisko B，et al. An RNA cap （nucleoside-2′-O-）-methyltransferase in the flavivirus RNA polymerase NS5：crystal structure and functional characterization[J]. The EMBO Journal，2002，21（11）：2757-2768.

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