高脂飼養C57BL/6J小鼠腎周脂肪組織炎性反應的評估

楊 永，李梓玉，楊 偉，劉 勇，2*

(1.西南醫科大學附屬醫院 病理科, 四川 瀘州 646000； 2.核醫學與分子影像四川省重點實驗室，四川 瀘州 646000)

隨著現代人的生活方式轉變以及生活水平的提高，肥胖人群逐年增多，肥胖的危害性日益凸顯，既往文獻報道，肥胖通常伴隨低度慢性炎性反應[1]。肥胖所導致的機體多種代謝異常，包括胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖代謝紊亂改變等與慢性炎性反應密切相關[2]。

巨噬細胞是分布于機體多種組織的一種重要免疫細胞。在適當的刺激下，巨噬細胞被激活為一種炎癥狀態，可以大致分為M1型和M2型兩類，兩者在功能和標志物等方面具有顯著差異。M1型表達CD11c，M2型表達CD206，M1型響應Th1型細胞因子呈促炎的表型，釋放IL-6、IL-1β等促炎性因子。M2型響應Th2型細胞因子呈抗炎的表型，釋放IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1、Fn1等抗炎性因子。因此促進M1型向M2型轉化，可以達到減輕脂肪組織炎性反應并改善脂肪組織功能障礙的目的，肥胖引起的脂肪組織炎性反應浸潤的炎細胞以M1型巨噬細胞為主，肥胖時脂肪組織功能失調，導致脂肪組織內部缺氧繼而發生壞死，能進一步吸引巨噬細胞聚集，促進脂肪組織功能失調和炎性反應之間的惡性循環[3-4]。脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages，ATMs)的聚集、蓄積并在脂肪組織局部原位增殖等是慢性炎性反應相關肥胖和機體多種代謝性疾病的主要關鍵病因。本研究采用高脂飼養(high-fat diet, HFD)的C57BL/6J肥胖小鼠，檢測其腎周脂肪組織炎性因子及炎細胞浸潤情況，評估本實驗所造的肥胖相關腎病模型腎周脂肪組織是否存在炎性反應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑：CD206、TGF-β1、Fn1、IL-10單克隆抗體(廈門慧嘉生物科技有限公司)；TNF-α、IL-1β、CD11c、MCP-1單克隆抗體和F4/80單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理:將小鼠隨機分為對照組(control組)及高脂飼養組(HFD組)，每組6只，對照組飼喂正常飼料(脂肪14%，蛋白質26%，碳水化合物60%)，高脂飼養組在適應性喂食正常飼料1周后接受連續14周的高脂飼料(脂肪45%，蛋白質20%,碳水化合物35%)飼養(D12451; Research Diet，New Brunswick，NJ)。14周末處死小鼠，剝離雙側腎臟及腎周脂肪。

1.2.2 用RT-qPCR檢測腎周脂肪組織中TNF-α、CD11c、IL-1β、MCP-1、IL-10、TGF-β1、CD206和Fn1 mRNA的表達量:收集腎周脂肪組織，浸泡在RNA later中，首先進行腎周脂肪組織總RNA抽提：從RNA later中取出腎周脂肪組織，4 ℃下充分勻漿，吸取上清，移入不含RNA酶的離心管內，加入氯仿200 μL，經過15 s劇烈振蕩后，放在冰上靜置2 min，經12 000×g離心15 min，將離心后的上清液轉入新的無RNA酶離心管，加異丙醇500 μL，充分混勻，靜置10 min，12 000×g離心10 min，棄上清，用75%乙醇1 mL洗滌，再經過7 500×g心5 min，棄上清；用100 μL RNase-Free 水溶解即為提取的總RNA。立即進行后續的反轉錄反應。

1.2.3 免疫組織化學檢測腎周脂肪及腎實質F4/80、CD68和LCA的表達:制作白片，脫蠟至水；二甲苯Ⅰ、II處理后，梯度乙醇脫水各5 min；抗原修復：2% EDTA修復液(pH=9.0)進行高壓修復；室溫下3%甲醇浸泡；再分別滴加一抗和第二抗，分別在27 ℃孵育60 min、30 min；DAB顯色，蘇木素復染；0.1%稀鹽酸分化，飽和碳酸鋰反藍；顯微鏡下觀察并采集圖片。運用Image-Pro Plus 6.0彩色圖像分析軟件進行定量分析：選取切片中棕黃色陽性染色區域，分析各視野下陽性吸光度(intensive absorbance，IA)及陽性面積(area)，計算平均吸光度(IA/area×100%)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 腎周脂肪組織巨噬細胞極化表型

與對照組相比，高脂飼養組腎周脂肪組織TNF-α、CD11C、IL-1β、MCP-1基因的mRNA表達水平上調(P<0.05)(圖1)。

2.2 腎周圍脂肪組織及腎臟實質內ATMs及炎細胞

腎周脂肪組織內出現較多量的以ATMs浸潤為主的炎細胞，與對照組相比，高脂飼養組腎周脂肪巨噬細胞標志物F4/80, CD68及炎細胞廣譜標志物LCA的表達均呈高表達(P<0.05)(圖2～4，表1)。

表1 兩組小鼠腎周脂肪組織中F4/80、CD68和LCA蛋白免疫組化平均吸光度值比較

*P<0.05 compared with control group圖1 兩組小鼠腎周脂肪組織各炎性因子mRNA的相對表達量比較

圖2 免疫組化顯示兩組小鼠腎周脂肪組織F4/80、CD68和LCA蛋白的表達

3 討論

全球的肥胖人口明顯增加使人類健康面臨極大的問題，給全球公共衛生領域帶來巨大挑戰，流行病學研究表明肥胖與胰島素抵抗、脂代謝紊亂、心血管疾病、慢性炎癥等密切聯系，巨噬細胞向M2型方向轉化有助于調節肥胖相關的炎性反應和胰島素抵抗，已成為肥胖相關代謝性疾病的新療法的重要靶點[5]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肥胖的動物模型脂肪組織內分泌量增加，這是首次將肥胖與炎性反應聯系起來[6]。肥胖條件下，脂肪組織主要浸潤的炎細胞是促炎性的M1型巨噬細胞[7-8]。M1型巨噬細胞能釋放促炎性因子(如IL-1β、IL-6等)，炎性因子進一步刺激M1型巨噬細胞分泌炎性因子，募集更多M1型巨噬細胞，最終形成脂肪組織功能障礙與炎性反應的惡性循環，并且炎性因子干擾脂肪細胞的胰島素相關信號通路，可導致胰島素抵抗的發生[9-10]。

圖3 免疫組化顯示兩組小鼠腎實質F4/80、CD68和LCA蛋白的表達Fig 3 F4/80, CD68 and LCA proteins in renal parenchyma of mice in two groups by immunohistochemistry(×200)

IHC.immunohistochemistry;*P<0.05 compared with control group圖4 兩組小鼠腎周脂肪組織巨噬細胞定量分析Fig 4 Quantitative analysis of macrophages in perirenal adipose tissue of mice in two groups

巨噬細胞相關標志物在高脂飼養小鼠白色脂肪組織中的表達量升高，巨噬細胞較特異的標志物F4/80陽性，并且陽性比例明顯升高[11]。因此，本研究選用了較為特異的巨噬細胞標志物F4/80，但也存在低表達及檢測不到的情況，因此，選擇了其他巨噬細胞標志物CD68聯合使用[12]，此外還選用了炎細胞廣譜標志物LCA對腎實質及腎周脂肪組織進行標記，結果提示HFD組腎周脂肪組織和腎實質內都發生了炎性反應，但主要發生在腎周脂肪組織。RT-qPCR檢測結果發現HFD組腎周脂肪組織中主要為M1型巨噬細胞分泌的炎性因子，而M2型巨噬細胞分泌的炎性因子沒有明顯升高，可能是高脂飲食誘導的肥胖相關腎病腎周脂肪炎性反應主要為促炎型巨噬細胞M1型主導。本研究結果與大多數關于肥胖導致的脂肪組織炎性反應特點較為一致；推測其作用機制與高脂飲食介導TLR-4炎性信號通路活化并產生大量炎性因子有關。

大量研究結果表明，肥胖引起的脂肪組織炎性反應主要以M1型巨噬細胞浸潤為主的原因與TLR4-MyD88信號通路密切相關，TLR4-MyD88信號通路刺激ATMs分泌白細胞介素-1β(IL-1β)，通過IL-1β刺激骨髓增生，從而單核細胞趨化進入又形成新的ATMs，如此形成惡性循環，結果就是使脂肪組織內巨噬細胞數量急劇增加，脂肪組織炎性反應加重[13-14]。有學者通過動物實驗研究發現高脂飲食可介導TLR-4信號通路活化，使IL-1β、IL-6等炎性因子在脂肪組織中的含量升高，從而導致機體出現代謝異常等改變[15]。巨噬細胞M1型與M2型的調節是一個較為復雜的過程。干擾ATMs的蓄積、募集以及在脂肪組織局部原位增殖并促進ATMs向M2型方向轉化可能成為預防和治療肥胖相關代謝異常性疾病的靶點。