基于全外顯子測序和生信分析的PRKAG2心臟綜合征家系 研究

雷景超，文 英，李曉艷，王京偉，蔣學俊

（1. 武漢大學人民醫院心內科，武漢 430060；2. 武漢大學心血管病研究所，武漢 430060；3. 心血管病湖北省重點實驗室，武漢 430060；4. 武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060）

肥厚型心肌?。℉ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種以心肌肥厚為特征的心肌疾病，臨床癥狀變異性大，可從長期無癥狀，到勞力性呼吸困難、胸痛、心慌、暈厥，到心源性猝死等［1］，是青少年和運動員猝死的主要原因之一［2］。2004年我國首次HCM流行病學調查表明中國HCM患病率為80/10萬，估測我國成人HCM患者超過100萬［3］。該病所引起的嚴重臨床不良事件具有顯著的年齡分層特點，在小于35歲的年輕患者多見心源性猝死，而心力衰竭死亡多發生于中年患者，老年患者則多發生HCM相關的房顫所致的卒中事件［1］。在三級醫療中心HCM患者年死亡率為2%～4%，目前主要治療手段包括藥物治療、外科手術、起搏器植入等，但均為對癥治療，缺乏徹底的治療方案，終末階段依賴于心臟移植。

2020年11月，美國心臟病學會/美國心臟協會（ACC/AHA）聯合發布的《2020年AHA/ACC肥厚型心肌病診斷及治療指南》更新HCM定義為“一類由于肌小節蛋白編碼基因或相關基因變異，或遺傳病因不明的左室心肌肥厚為特征的心臟疾病”，強調臨床診斷HCM時需加強對HCM擬表型的篩查［4］。本研究中研究對象為湖北地區一因攜帶PRKAG2 c.1589A＞G（p.His530Arg）雜合錯義突變而導致以家族性心室預激、傳導系統異常及心肌肥厚為主要臨床表現的典型PRKAG2心臟綜合征家系，主要目的是探究臨床癥狀的分子生物學基礎，以期為提高對HCM及HCM擬表型的認識及臨床診斷提供參考，為心血管病精準醫療事業做出貢獻。

1 資料與方法

1.1 對象及臨床資料先證者及其家系成員來自于湖北省孝感市。先證者于2011年1月在我院診斷為肥厚型心肌病 預激綜合征 竇性心動過緩并行永久起搏器植入術。其子于2018年6月在我院診斷為 肥厚型心肌病 預激綜合征 心房顫動 心房撲動并行射頻消融術。詳細詢問先證者及其家系成員病史、存活情況、家族史等，進行體格檢查、心電圖、心臟彩超等檢查，繪制家系系譜圖（圖1）。

圖1 患者家系系譜圖

1.2 基因篩查本研究與先證者及家屬簽訂知情同意書。根據臨床癥狀以及家族史對先證者進行全外顯子測序，獲得可疑突變后，再用sanger測序驗證是否存在家系共分離。

1.3 生信分析用測序結果進行生物信息學分析探索患者二尖瓣冗長的原因以及II-6比III-4表現出更嚴重臨床表現的原因。

2 結果

2.1 一般臨床情況先證者，女，（II-6），39歲。2011年初夜間休息時突發渾身無力、無法言語、牙關緊閉、大汗，隨后意識喪失，數分鐘后意識轉清，間隔數分鐘后后上述癥狀再發，送往當地醫院治療期間心電監護示癥狀發作時心率低至20次/分，后轉入我院，查心肌酶譜正常，心電圖示預激綜合征，電軸左偏，左室勞損。長程心電圖（Holter）示 竇性心律，平均心率39bpm，最小心率29bpm，最快心率70bpm，有705個大于2.0s的停搏，最長2.5s，頻發房性早搏12663個，部分房早未下傳，房性心動過速11陣。心臟超聲示 左房內徑（LAD）=33mm，左室舒張期內徑（LVDD）=44mm，右房內徑（RAD）=36mm，右室舒張期內徑（RVD）=19mm，舒張期室間隔厚度（IVSD）=21mm，舒張期左室后壁厚度（LVPWD）=12mm，左室射血分數（EF）=56%，各瓣膜形態、啟閉未見異常。靜息態下，左室流出道最高壓差6.86mmHg。超聲考慮：非對稱性肥厚型心肌?。o息狀態下未見梗阻）。診斷為肥厚型心肌病 預激綜合征 竇性心動過緩并行永久起搏器植入術（AAI起搏）。出院后停用口服藥物。近兩年開始出現活動后乏力、胸悶、喘氣不適，活動奶量下降，久站和久坐后出現雙下肢水腫。此次因起搏器電池耗竭于2020年9月再次入院。入院查體：BP 107/72mmHg R 20次/分 P：60次/分 T 36.3℃。神清，精神可，皮膚鞏膜無黃染，左小腿、大腿及左上臂可見4處灰色直徑約0.5cm圓形皮疹。心電圖：房室順序起搏心律、起搏電軸輕度左偏。心臟超聲：LAD=40mm，LVDD=32mm，RAD=30mm，RVD=17mm，IVSD=26mm，LVPWD=21mm，室間隔與左室壁顯著增厚，以室間隔為主，EF=53%，二尖瓣前葉冗長2.7cm，瓣膜稍厚0.6cm，未見明顯SAM現象。靜息態下，左室流出道未見明顯高速射流。超聲考慮：符合肥厚型心肌病聲像圖改變（靜息狀態下未見梗阻），起搏器植入術后：起搏器未見異常。

2.2 家族成員情況II-1為先證者弟弟，早夭。III-4為先證者兒子，19歲。2018年6月因“突發心慌、胸悶7小時余”曾于我院住院治療，診斷為“肥厚型心肌病 預激綜合征 心房顫動 心房撲動”并行心導管射頻消融術。術后口服琥珀酸美托洛爾緩釋片治療并門診隨訪，隨訪過程中無明顯不適，但Holter示心率逐漸減慢，致琥珀酸美托洛爾緩釋片逐漸減量至停服。2020年9月復查心臟超聲：LAD=38mm，LVDD=42mm，RAD=36mm，RVD=20mm，IVSD=31mm，LVPWD=24mm，EF=53%，室間隔與左室壁顯著增厚，以室間隔為主，最厚處約3.3cm，右心室壁厚約1.2cm，二尖瓣前葉冗長2.7cm，啟閉可，未見明顯SAM現象。靜息態下，左室流出道血流速度稍快，峰值流速約145cm/s，壓差8mmHg。超聲考慮：符合肥厚型心肌病聲像圖改變（靜息狀態下未見梗阻）。Holter提示 竇性心律伴竇性心動過緩，伴交界性逸搏及房性逸搏心率，平均心率44bpm，最慢心率31bpm，最快心率108bpm，室性早搏2個，房性早搏總數584個，大于2.0s的長間歇84個，最長2.172s。其余家族成員均未發病，無相關臨床癥狀，心電圖及心臟超聲檢查無明顯異常。

2.3 全外顯子測序結果先證者II-6一共339個可疑突變，涉及172個蛋白編碼基因，致病可能性較高且評級在D以上的基因突變共4個。

先證者兒子III-4一共361個可疑突變，涉及176個蛋白編碼基因，致病性較高的突變共7個。

表1 家系B中先證者III-4致病性較高突變

表2 家系B中III-4患者致病性較高突變

2.4 家系成員Sanger法驗證測序根據先證者候選基因篩查結果，對獲取的家系成員外周血標本進行PRKAG2基因位點Sanger測序（圖2），結果提示其子（III-4）攜帶該雜合突變，其余親屬未檢出此變異。先證者及其兒子所攜帶的基因突變情況與臨床表型相符，存在家系共分離，因此判定PRKAG2 c.1589A＞G（p.His530Arg）雜合變異為該家系的致病突變。PRKAG2基因c.866A＞G雜合錯義變異（p.His289Arg）和PRKAG2 c.1589A＞G（p.His530Arg）為同一個位點，只是因為轉錄本不同而有不同的命名。

母子二人共有的其他突變位點所相關的疾病表征并不能覆蓋患者的臨床表現，并且缺乏共分離家系以及功能學證據的支持，所以證實PRKAG2 c.1589A＞G（p.His530Arg）為該家系致病突變。

2.5 驗證性分析整合母親172個發現突變的基因，使用WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit進行通路富集，選擇KEGG數據庫和Reactom數據庫，使用Overrepresentation Analysis方法，選定參考序列為編碼蛋白序列，富集到以下通路：

同理可得其子的通路富集情況：

可知II-6患者一共有143個基因被選中，被富集到的富集比（Enrichment ratio）＞5的通路共9條；III-4患者一共150個基因被篩出，富集到的通路一共9條。由于二者的二尖瓣冗長相似，認為是遺傳因素作用很大，因此取這9條通路的交集。

（1）MET激活的PTK2通路（2）非整聯蛋白膜-ECM相互作用（Non-integrin membrane-ECM interactions）（3）ECM蛋白聚糖（ECM proteoglycans）（4）整合素細胞表面相互作用（Integrin cell surface interactions）

綜合以上的信號通路來說，很難找到和二尖瓣冗長、二尖瓣脫垂或者二尖瓣異常形態學變化直接相關的信號通路，大多數為有關于ECM的信號通路，而ECM信號通路如果有異常，僅在二尖瓣表現出癥狀的概率很小。另外，和胚胎發育相關的PTK2信號通路，僅作用于精子和卵子形成胚胎階段。

2.6 探索性分析找尋所有可能導致二尖瓣形態學異常的疾病，主要的編碼蛋白基因有ADAM17、ADAM19、ARSB、BMPR1A、CREBbp、CXCR4、CYR61、DNAH11、DOCK1、EFNA1、EFNB2、EHMT1、GJA5、HBEGf、HEY2、IDUA、MEGF8、NF1、NFATC1、NTF3、NTRK3、PDLIM7、RXRA、SH3PXD2B、SMAD6、SOX9、TLL1共27個。在KEGG、Reactome、PathCards等數據庫分別找尋包括上述基因的通路，分析通路中包含的其他基因與II-6患者突變基因的相關性，相關性較高的。

圖3 先證者II-6富集通路結果

圖4 患者III-4富集通路結果

ARSB所在的溶酶體通路；CREBbp相關的wnt蛋白通路、JAK/STAT通路、松弛素信號通道；DOCK1基因所在的肌動蛋白細胞骨架調節通路、NTF3基因所在的PI3K-Akt信號通路、SOX9基因所在的cAMP信號通路。

除開以上通路外，其余的基因所在的信號通路均為調控例如腫瘤轉移、免疫細胞和T細胞等與二尖瓣形態學并無明顯關聯的通路或者有關聯但交叉基因很少。而上述列出的信號通路功能復雜，包含蛋白編碼基因甚多，廣泛存在于各個組織、各種生理過程，難以證明單獨和二尖瓣形態學相關。但是值得注意的是，NTF3基因所在的PI3K-Akt通路，在糖代謝中扮演著重要的角色。PI3K由p85調節亞基和p110調節亞基形成的異源二聚體。PI3K活化后加速含有葡萄糖轉運體-4（glucose transporter，GLUT）的囊泡向膜轉運，并鑲嵌在細胞膜上，調節細胞對葡萄糖的攝取。另一方面抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表達，從而抑制糖異生，增加葡萄糖的利用和糖原合成。PS發病的重要一環即糖原貯積在心肌細胞和傳導組織中，有文獻指出PI3K-Akt-mTOR途徑可能和PS患者心肌肥厚相關。對比II-6和III-4患者突變基因集和PI3KAkt信號通路包含的所有上下游基因。發現II-6患者突變中有14個基因共31個位點，III-4患者有15個基因共23個位點。推測II-6比III-4患者在PI3K-Akt通路相關基因上有更密集的突變，可能導致II-6患者表現出昏厥等更嚴重的臨床表型。

表3 家系中患者PI3K-Akt通路基因對比結果

3 討論

對于PRKAG2心臟綜合征，目前尚無指南對其治療給出明確推薦，臨床仍參照HCM治療指南，以對癥治療為主：對于有心力衰竭癥狀者，需進行規范化抗心力衰竭治療；終末期心力衰竭患者可考慮心臟移植；心肌明顯肥厚者應避免脫水［6］。值得思考的是本家系中兩例患者均出現了心室壁顯著增厚，最厚處分別達2.6cm及3.3cm，顯著增厚的室壁導致心腔明顯縮小，那么此種情況是否具有室間隔心肌消融術或外科室間隔心肌切除術的指征？按照現有證據，答案是否定的。據現有資料，PRKAG2心臟綜合征通常不伴左室流出道梗阻和SAM征［1、7］，本家系中兩例患者心臟超聲提示左室流出道并無梗阻。

先證者及其子的臨床表現相似，且和PRKAG2心臟綜合征的臨床表型高度吻合。除外二尖瓣冗余外，仍然有值得探索的地方：II-6在最初發病時為31歲，III-4發病為19歲，后者在更輕的年齡發病，同樣的性別差異在HCM中也有報道，并被認為和雌激素水平相關［8］；Danon綜合征也表現為類似的性別差異［1］，是否為糖原貯積病的普遍規律尚未可知；根據臨床觀察，我們發現在家族性HCM患者中，也存在發病逐代提前的現象，是修飾基因的存在導致下一代發病提前抑或是存在特殊的機制導致的代際遺傳普遍特點？

綜上所述，本研究通過對一疑似肥厚型心肌病家系的臨床資料進行詳實分析后，擬診PRKAG2心臟綜合征，并通過基因檢測證實該家系攜帶PRKAG2 c.1589A＞G（p.His530Arg）雜合錯義突變，從而明確診斷。這一案例的診療從方法上踐行了HCM診斷流程并且證實其是有意義且必要的，同時豐富了我國的PRKAG2的致病突變譜，有助于未來的精準醫療的推行和實施。同時，將生信分析應用于PRKAG2突變患者的分子生物學基礎，在眾多基因中富集分析可能導致二尖瓣形態學變化的基因。認為PI3K-Akt通路可能和PS患者表現出更嚴重的臨床癥狀相關。