一種基于適配體傳感器的17β-雌二醇定量分析方法

史學麗，高輝，周永紅，趙偉

摘要：為了靈敏、特異地測定牛奶中17β-雌二醇（E2）的含量，解決傳統方法測定時因原位激發導致的熒光背景干擾、樣品預處理復雜等問題，基于熒光共振能量轉移（FRET）原理，結合適配體與靶標的特異性識別，建立一種基于熒光適配體傳感器的E2定量分析方法。采用水熱合成法制備銪（Eu3+）摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子，并將E2適配體修飾到納米粒子（PLNP）上，形成復合物（PLNP-Aptamer）。以PLNP-Aptamer為能量供體，以二硫化鉬納米片為能量受體，根據熒光強度與靶標17β-雌二醇之間的線性關系實現對E2的檢測，并對檢測條件進行優化。結果表明，當PLNP-Aptamer、二硫化鉬的質量濃度分別為0.1，0.8 mg/mL，E2與適配體的孵育時間為20 min，pH值為7.0時，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL。通過加標回收實驗，證明檢測體系對17β-雌二醇具有顯著的選擇性，可用于實際樣品的檢測。所提方法解決了樣品預處理復雜耗時，乳基質熒光干擾等問題，可為基層衛生監督工作提供一種簡單、高效、成本低廉的雌激素檢測方法，對其他環境雌激素的檢測也具有參考價值和借鑒意義。

關鍵詞：應用生物化學;熒光;納米傳感器;二硫化鉬;鎵酸鋅

中圖分類號：R926文獻標識碼：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx05005

A quantitative analysis method for 17β-estradiol based on aptasensor

SHI Xueli1，GAO Hui1，ZHOU Yonghong1，ZHAO Wei2

（1.Shijiazhuang Maternity and Child Healthcare Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China;2.Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang，Hebei 050019，China）

Abstract：In order to determine the content of 17β-estradiol （E2） in milk sensitively and specifically，and solve the problems such as the interference of fluorescence background caused by in-situ excitation and the complexity of sample pretreatment in the traditional method，a quantitative analysis method for 17β-estradiol based on fluorescence aptasensor was constructed on grounds of the fluorescence resonance energy transfer （FRET），combined with the specificity of the aptamer and target recognition.Persistent luminescence nanoparticles （PLNP） doped with Eu3+ were prepared by the hydrothermal method and modified with E2 aptamers onto PLNP to form the coupling complex PLNP-Aptamer.In this method，PLNP-Aptamer was used as energy donor.MoS2 was used as the acceptor.According to the linear relationship between phosphorescent intensity and target E2，the content of E2 was detected，and the detection conditions were optimized.The results show that when the concentrations of PLNP-Aptamer and MoS2 are 0.1 mg/mL and 0.8 mg/mL respectively，the reaction time of E2 and aptamer is 20 min，pH is 7.0，the linear detection scope of E2 concentration is from 0.6 ng/mL to 80 ng/mL and the detection limit is 0.4 ng/mL.The adding standard recovery experiment proves that the detection system has high specificity to E2，and can realize quantitative detection of E2 in actual samples.The method provides a simple，efficient and low-cost estrogen detection method for grass-roots health supervision by solving the problem of the complicated time-consuming of sample pretreatment and avoiding the fluorescence interference of milk matrix.It also provides a reference for other environmental estrogens detection.

Keywords：applied biochemistry;fluorescence;nanosensor;MoS2;ZnGa2O4

17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一種具有內分泌干擾效應的內源性雌激素，過量攝入可嚴重干擾內分泌系統[1-2]。目前，在多種水源、食物中均檢測出E2[3-6]。雖然含量低，但可通過生物放大效應引起體內富集，具有較強的生物蓄積毒性。為保障食品安全，建立食品中E2的實時監測意義重大。常用的E2檢測方法有色譜法[7-8]、免疫學方法[9]和適配體傳感法[10-11]等。

適配體是經體外篩選得到的一段能與配體高親和力特異性結合的寡核苷酸序列，相對于以抗體作為生物識別分子的生物傳感器[12-13]，適配體易于修飾，穩定性高，對目標物具有極好的選擇性[14]，為分析識別配基提供了更好的選擇，且基于核酸適配體的生物傳感器在檢測領域應用前景廣闊[15-16]。熒光傳感器已應用在多種食品檢測中[17-19]。然而，大多數熒光檢測都是在可見光范圍內基于熒光猝滅模式進行，其抗干擾能力較差，定量范圍比較窄，尤其對于牛奶這種復雜樣品的檢測，其無法避免原位激發導致的脂質自體熒光等背景噪音的干擾。

隨著分析化學及材料科學的迅速發展，以長余輝納米粒子（PLNPs）為基礎的納米探針成為生物分析和生物成像的新一代光學探針[20-23]，可以在沒有進一步激發的情況下，持續數小時發光[24]，并可重復利用，能有效避免原位激發產生的背景干擾，很大程度上增加了檢測的靈敏度及信噪比。稀土離子是發光材料中應用最廣的一類激活劑，由于熒光效率高、熒光譜帶窄而被廣泛應用于PLNPs的制備中。銪（Eu3+）離子作為激活劑摻雜到各種基質中，通過改變缺陷的深度和密度，使PLNPs余輝強度和余輝時間都普遍提高[25-26]。

因此，筆者基于熒光共振能量轉移（FRET）原理，通過水熱合成法制備了銪摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子ZnGa2O4：Eu3+，將PLNP-Aptamer（適配體修飾的長余輝納米粒子）作為FRET供體，MoS2納米片為受體，結合適配體與靶標的特異性識別，構建了一種靈敏、特異的E2定量分析方法，有效避免了牛奶基質等因素產生的背景干擾。

1主要材料與儀器

1.1藥品與試劑

實驗所用的試劑均為分析純。硝酸鋅（Zn（NO3）2·6H2O）、氧化鎵（Ga2O3）、氧化銪（Eu2O3）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、4-（N-馬來酰亞胺甲基）環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC）、雙酚A（BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（E3）和17β-雌二醇（E2），均由上海阿拉丁生物技術有限公司提供;二硫化鉬納米片（MoS2），江蘇先豐納米材料科技有限公司提供;3%（體積分數，下同）冰醋酸、二甲基甲酰（DMF）和氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司提供。E2適配體序列：（5′-SH-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3′），上海生工生物工程有限公司提供;牛奶，購于本地超市。

1.2儀器

JEM-2100透射電子顯微鏡、F-7000熒光分光光度計、SU8010掃描電子顯微鏡，日本日立公司提供;X-射線衍射儀，Zeta電位分析儀，德國布魯克公司提供;IS10傅里葉變化紅外光譜儀，美國熱電公司提供;恒溫加熱磁力攪拌器，山東甄城華魯電熱儀器有限公司提供;KQ-100DB型數控超聲波清洗儀器，昆山市超聲儀器有限公司提供;BSA124S電子天平，ST3100實驗室pH計，奧豪斯儀器有限公司提供。

2試驗方法

2.1E2的檢測原理

熒光共振能量轉移（FRET）技術是指熒光供體的發射光譜與受體的吸收光譜存在重疊，當能量供體和能量受體之間的距離小于10 nm時，供體和受體之間發生熒光共振能量轉移。因此，可以利用供-受體距離變化導致的熒光強度變化來反映分析物的含量?；贔RET的E2檢測原理如圖1所示。經氨基修飾的PLNPS標記E2適配體，形成PLNP-Aptamer作為能量供體，選擇MoS2納米片作為受體，PLNP-Aptamer吸附在MoS2表面而形成FRET體系，PLNP-Aptamer的熒光被猝滅;當體系中存在E2時，E2與適配體標記的PLNP-Aptamer特異性結合，從而破壞PLNP-Aptamer與MoS2之間熒光共振能量轉移體系，使PLNP-Aptamer的熒光恢復，熒光強度與E2的濃度呈線性關系，據此實現對E2的檢測。

2.2PLNPs的制備與修飾

長余輝納米粒子（ZnGa2O4：Eu3+PLNPs）的制備：采用水熱法合成PLNPs[25，27]，首先按照ω（Zn）∶ω（Ga）∶ω（Eu）=1∶1.999∶0.001的化學計量比取適量Zn（NO3）2·6H2O和Ga2O3粉末混合，然后加入Eu2O3粉末，快速攪拌下緩慢滴加NaOH溶液，調節pH值至12，將混合溶液轉移至聚四氟乙烯內襯的反應釜中，于210? ℃中反應72 h。反應完成后，將產物離心分離（10 000 r/min，5 min），棄去上清液。用超純水和乙醇分別洗滌5次和3次，置于真空干燥箱中105 ℃干燥4 h。

羥基修飾的長余輝納米粒子PLNP-OH的制備：取ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs 400 mg，超聲分散于80 mL的NaOH溶液（50 mmol/L），使其濃度為5 mg/mL，室溫條件下攪拌24 h，然后離心分離，用超純水洗滌3次，所得產物室溫真空干燥24 h，備用。

氨基修飾的長余輝納米粒子PLNP-NH2的制備：取250 mg PLNP-OH，超聲分散至二甲基甲酰胺（DMF），濃度為2.5 mg/mL。攪拌下加入10 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），滴加完成后將反應體系置于80 ℃水浴中，攪拌下反應24 h，然后離心分離，用DMF洗滌3次，無水乙醇洗滌1次，所得產物真空干燥24 h，備用。

2.3氨基化納米粒子與雌二醇適配體的偶聯（PLNP-Aptamer）

稱量1 mg PLNP-NH2和0.2 mg Sulfo-SMCC，加入到1 mL 的HEPES緩沖液（10 mmol/L，pH=7.2），混合均勻后在25 ℃下振蕩30 min，使PLNPs表面修飾的氨基充分活化。離心收集活化的PLNPs-NH2， 用Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH=7.4）洗滌3次。然后將PLNPs-NH2加入含E2適配體（2 nmol/mL）的Tris-HCl緩沖溶液中，室溫下充分孵育12 h，離心收集備用。

2.4標準溶液及牛奶樣品的配置

配置不同濃度的E2標準儲備液，溶劑為 Tris-HCl 緩沖溶液，備用。

10 mL本地市售牛奶樣品加入3%冰醋酸，10 ℃離心（10 000 r/min，10 min），取上清液。處理后的牛奶樣品用 Tris-HCl 緩沖溶液稀釋，-4 ℃保存備用。

2.5E2標準曲線的制作

分別取 500 μL的PLNP-Aptamer（0.1 mg/mL）和500 μL的MoS2納米片（0.8 mg/mL），混合均勻后37 ℃孵育15 min，后立即加入1 500 μL E2標準品溶液，混合均勻后37 ℃孵育15 min。使用熒光光譜儀測定樣品熒光光譜，選取紫外吸收峰的最大波長254 nm為激發波長[28]，考察發射峰710 nm處的熒光強度，制作標準曲線。

3結果和討論

3.1PLNP納米粒子和MoS2納米片的表征

1）PLNP納米粒子的表征如圖2、圖3所示，透射電鏡（TEM）的結果顯示制備的納米粒子顆粒均勻，粒徑為10～20 nm （見圖2 a））;對PLNP，PLNP-NH2，PLNP-Aptamer 進行X射線衍射表征，結果見圖2 b），XRD譜圖與ZnGa2O4的標準譜圖一致，未出現非均相峰，說明合成的ZnGa2O4：Eu3+為尖晶石構型，純凈無雜質。氨基修飾后的PLNP-NH2，FT-IR光譜（見圖2 c））可以看出波數為1 120 cm-1和1 040 cm-1的2個峰對應于O-Si-O的伸縮振動吸收峰，2 929 cm-1和2 872 cm-1處出現了不對稱和對稱的-CH2的伸縮振動吸收峰，說明在ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs顆粒表面修飾上了-NH2。由ZnGa2O4：Eu3+納米材料的發射光譜所示（見圖3 a）），其在254 nm激發波長下，最大發射波長為710 nm，Stokes位移高達460 nm，充分說明合成的納米材料背景干擾低、檢測靈敏度高，適用于本實驗的定量檢測。

2）MoS2納米片及其與PLNP-Aptamer復合物的表征由圖3 a）粗線所示，MoS2占據UV-vis-NIR吸收譜，吸收光譜范圍廣，與PLNP-Aptamer的熒光發射光譜有很大的重疊交叉區域?；贔RET原理，PLNPs作為供體發射的熒光可以被MoS2受體吸收而發生熒光猝滅。此外，通過范德華力將帶負電荷的適體功能化的PLNP-Aptamer吸附到MoS2納米片上，進一步縮短了PLNPs與MoS2之間的距離，有效產生了FRET。

3.2檢測條件的優化

1）MoS2用量的優化固定PLNP-Aptamer的MoS2質量濃度（下同）為0.5 mg/mL，加入不同濃度的MoS2，從而對其用量進行優化，將MoS2的濃度從0逐漸添加到1.0 mg/mL時，PLNP熒光強度在254 nm的激發下逐漸下降，當加入量為0.8 mg/mL時，體系的熒光淬滅強度進入平臺期，熒光強度不再有明顯變化;當加入量為1.0 mg/mL時，熒光強度的淬滅效率高于95%（見圖3 b））。綜合考慮光散射效應及熒光猝滅強度因素，本實驗選擇0.8 mg/mL作為隨后檢測中 MoS2的用量。

2）PLNP-Aptamer供體與MoS2受體孵育時間的優化隨著孵育時間的增加，當孵育時間為15 min時，熒光猝滅幾乎達到最大，PLNP-Aptamer供體與MoS2受體反應接近飽和（見圖3 c）），圖中I0代表只有PLNP-Aptamer時的熒光強度，I代表加入MoS2時PLNP-Aptamer的熒光強度。

3）FRET體系pH值的優化核酸適配體是一種具有特定空間構型的單鏈DNA，其空間構型對其與E2的結合能力有重要影響。pH值對單鏈 DNA 的三維空間結構有很大影響。因此筆者考察了pH 值對檢測的影響。結果如圖4所示，當 pH值為7.0時，在0.8 mg/mL MoS2納米片中加入E2后，核酸適配體對E2的親和力最強。因此，選擇pH值7.0用于隨后的檢測。

4）E2與適配體的孵育時間的優化PLNP-Aptamer與MoS2發生熒光共振能量轉移導致 PLNP-Aptamer 的熒光猝滅;而E2的加入會使得其適配體空間結構改變，使得PLNP-Aptamer與MoS2分離，PLNP-Aptamer的熒光得到恢復。為了達到最佳的熒光恢復效果，需對E2的孵育時間進行優化。隨著孵育時間的增加，PLNP-Aptamer在710 nm處的熒光強度ΔI/I0不斷增加。當孵育20 min時，熒光強度恢復到最大，之后基本保持不變（見圖5），因此孵育時間選擇為20 min。

3.3標準曲線

為考察該方法的靈敏度，測定其線性范圍和檢出限。在最佳條件下，將不同濃度（0.6～1 100 ng/mL）E2加入檢測體系，考察710 nm處熒光強度的變化，分析定量范圍。結果如圖6所示，無E2時熒光發射強度最低，隨著E2濃度增加體系熒光強度隨之增強（見圖6a））;采用線性擬合，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL（見圖6 b））。

3.4特異性考察

為評價本方法對E2檢測的特異性，選擇E2結構類似物雙酚A （BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（estriol）4種環境雌激素進行研究，分別測定了質量濃度均為50 ng/mL的E2和其他4種環境雌激素，以牛奶為空白樣本做陰性對照。結果如圖7所示，適配體對E2具有較高的親和性，特異性結合使PLNP脫離MoS2表面，PLNP熒光恢復，發射強度大幅度增強。由于E2適配體強特異性，對E2的結構類似物雙酚A、己烯雌酚、雌三醇進行測定時親和力弱，不能引起PLNP-Aptamer脫離MoS2表面，熒光強度恢復不明顯。以上結果表明，本文所建立的基于FRET的熒光傳感器對E2具有良好的選擇性。

4回收試驗

為了考察E2檢測方法的準確性和在實際牛奶樣品檢測中的分析能力，對牛奶樣品進行加標回收試驗。在牛奶樣品中加入不同濃度的E2標準品，按本方法測定E2含量，結果如表1所示，回收率在91.2%～100.5%。試驗結果表明，本文所建立的基于適配體的熒光傳感器對E2實際樣品的檢測具有良好的準確性，可實現無色譜分離情況下對牛奶中E2的檢測。

5結語

筆者基于FRET原理，采用水熱合成法制備了銪摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子，并通過適配體與靶標E2的特異性結合構建了一種E2定量分析方法，主要結論如下。

1）實驗合成的納米粒子顆粒均勻，純度高，與MoS2的熒光發射光譜有很大的重疊交叉區域，可實現FRET。

2）通過標記E2適配體的長余輝ZnGa2O4：Eu3+納米粒子（PLNP-Aptamer）與MoS2納米片，構建了熒光共振能量轉移檢測體系，結果表明當納米粒子與雌二醇適配體的偶聯復合物、二硫化鉬質量濃度分別為0.1，0.8 mg/mL，孵育時間為20 min，pH值為7.0時，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL。該適配體傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測目標分子，并能夠避免乳基質和類似物的熒光干擾。

3）特異性考察結果顯示本研究建立的檢測體系對E2的結構類似物雙酚A、己烯雌酚、孕酮、雌三醇的親和力弱，可在無色譜分離的情況下，實現對牛奶這類復雜樣品中E2的高選擇性定量檢測。

4）加標回收試驗顯示牛奶樣品的回收率為91.2%～100.5%，本法在實際樣品檢測中具有較好的準確性、穩定性和檢測特異性，可以實現E2的靈敏檢測。

本方法無需復雜的樣本預處理，操作簡單、快捷，可避免原位激發導致的熒光干擾，檢測特異性高;同時適配體價格低、性質穩定，是一種簡單、高效、成本低廉的雌激素檢測方法。但該研究樣本較為單一，今后將進一步擴大研究樣本，建立更多食品樣本中雌激素的檢測方法，為健全食品安全標準體系提供參考借鑒。

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