小分子肽LK-5對肝纖維化小鼠的防治效果初步研究

廖彭瑩 楊玉蓉 韋引金 宋采鮮 黃艷瑩 韋春鳳 陳海平 李錦清 林燕媚

【摘 要】 目的：探討小分子肽LK-5對CCl4致小鼠肝纖維化的防治效果。方法：將昆明小鼠隨機分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組和小分子肽低（15 mg/Kg）、高劑量組（60 mg/Kg）。采用皮下注射25%CCl4-橄欖油誘導建立小鼠肝纖維化模型。連續8周后，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝臟組織病理學變化，采用試劑盒法檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）的水平及肝組織中丙二醛（MDA）、過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和羥脯氨酸（Hyp）的含量。結果：與模型組相比，小分子肽可改善小鼠肝組織病理學結構病變，顯著降低CCl4致肝纖維化小鼠血清的AST、ALT水平和肝組織MDA、Hyp含量，肝組織GSH-Px和SOD含量均明顯升高。結論：小分子肽對CCl4所致肝纖維化小鼠具有改善作用，其機制可能與抗脂質氧化和清除自由基有關，其是否通過肝內腎素-血管緊張素系統（RAS）發揮作用仍有待進一步研究。

【關鍵詞】 小分子肽;肝纖維化;CCl4;防治

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）17-0038-04

Preliminary Studies on the Prevention and Treatment of the Peptide LK-5 on Carbon Tetrachloride Induced Hepatic Fibrosis in Mice

LIAO Pengying YANG Yurong WEI Yinjin SONG CaixianHUANG Yanying WEI Chunfeng CHEN Haiping LI Jinqing LIN Yanmei

Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China

Abstract：Objectives to investigate the protective effect of the peptide LK-5 on carbon tetrachloride induced hepatic fibrosis in mice. Methods The Kunming mice were randomly divided into normal group，model group，Colchicine group，low-and high-dose （15 and 60 mg/Kg） peptide groups. The mice were sc injected with 25%carbon tetrachloride （CCl4） to establish hepatic fibrosis model.Continuous 8w later，the liver histology of tissue pathology were determined by hematoxylin-eosin （HE） staining. The activities of the alaninetransarninase （ALT） and aspartate transferase （AST） of the serum and the activities of malondialdehyde （MDA），superoxide dismutase （SOD），glutathione peroxidase （GSH-Px） and hydroxyproline （Hyp） in liver tissue were investigated by related reagent kits. Results Compared with the model group，the pathological changes of liver histopathology wereimproved，the AST and ALT levels of the serum，the MDA and Hyp contents of the liver tissue were reduced，and the activities of GSH-Pxand SOD were increased significantly.Conclusions the peptide showed improvement effects on the hepatic fibrosis mice induced by CCl4，and the mechanism may be related with anti-lipoid peroxidation and clearing out free radicals. Whether the mechanism is related with the renin-angiotensin system （RAS） in liver remains to be further studied.

Keywords：Peptide; Hepatic Fibrosis; CCl4;Protective Effect

器官纖維化是是指由于炎癥刺激導致器官實質細胞壞死，細胞外基質異常增多及過度沉積的一種病理過程，若不及時治療會發展為器官硬化甚至器官衰竭[1]，肝纖維化是其中一種，是多種慢性肝病共同的病理變化，是肝硬化發展的必經階段[2]。我國肝病發病率高、影響面廣，約1.2億人攜帶乙肝病毒，約1/4病人會發展成慢性肝病，包括肝纖維化[3]。

RAS系統是人體非常重要的內分泌系統[4]，其主要功能是維持血壓穩定，同時局部組織RAS系統會通過自分泌、旁分泌和胞分泌等路徑維持機體平衡，分泌過多會引起器官纖維化[5]。ACE（血管緊張素轉化酶）為RAS系統的關鍵酶，主要功能是切除血管緊張素I（Ang I）的羧基端二肽生成血管緊張素II（Ang II），Ang II的主要功能是介導血管收縮，引起血壓升高，同時Ang II可通過多種路徑誘導或促進器官纖維化[6]。臨床使用的ACE抑制劑卡托普利、賴諾普利、依那普利等除了具備降血壓功能外，對局部組織RAS系統中ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang （l-7）-Mas軸的主要成分也能產生影響，從而抑制器官纖維化病變[7-9]。因此，以ACE為靶點篩選的活性物質可能具有控制血壓、抑制器官纖維化病變等多重效應。

鱉甲為鱉科動物中華鱉（Pelodiscus sinensis Wiegmann）的背甲，有滋陰清熱、退熱除蒸、軟堅散結的功效[10-11]。臨床中醫將單方炙鱉甲[12]及鱉甲復方[13-14]等用于治療慢性肝纖維化。肽類成分是鱉甲的主要活性物質，已經從鱉甲中分離鑒定出多個具有抗肝纖維化的活性肽類[15-20]。在前期研究中，本課題組從鱉甲中分離鑒定了具有ACE抑制作用的小分子肽LK-5，IC50值為75.6 μmol/L[21]，其能否發揮抗肝纖維化作用值得探討。本論文采用肝纖維化小鼠模型初步探討了該小分子肽的防治效果。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠體質量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002，適應性飼養一周。

1.2 藥物與主要試劑 小分子肽LK-5（>99.0%）由上海吉爾生化有限公司合成，秋水仙堿購自西雙版納版納藥業有限責任公司，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，CCl4為分析純，購自天津市富宇精細化工有限責任公司，橄欖油購自重慶江源油橄欖開發有限公司。

1.3 主要儀器 BSA224S 型電子天平（ 北京賽多利斯儀器系統有限公司），CP100NX型離心機（株式會社日立制作所），Infinite M200 PRO型全波長多功能酶標儀（瑞士TECAN），微板恒溫震蕩器（上海滬析實業有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司），超純水儀（南京易達科技發展有限公司）

1.4 分組、造模與給藥 小鼠隨機分為小分子肽低、高劑量組、空白對照組、模型組、秋水仙堿組，除模型組15只外，其余各組均為12只。采用皮下注射25%CCl4橄欖油溶液造模，1 次/3 d，每次2 mL/Kg。同時，小分子肽低、高劑量組按15、60 mg/Kg皮下注射給藥，陽性對照組以秋水仙堿按0.4 mg/Kg灌胃給藥，1次/d。正常組和模型組均灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續8周。

1.5 取材 末次給藥后，小鼠斷食不斷水過夜，稱定小鼠質量，摘取眼球取血。將血液于3000 rpm離心15 min后，收集上清液，-80 ℃保存待檢。肝左葉用20%福爾馬林固定，進行HE染色。取適量肝右葉低溫制成10%肝勻漿，離心留上清液-80 ℃保存待檢。

1.6 觀察指標

1.6.1 小鼠體質量及行為學變化 每3天稱一次體重，記錄小鼠體質量變化。記錄小鼠每天進食量。觀察小鼠的飲食量、毛發光澤程度和精神狀態。

1.6.2 肝臟病理組織學檢查 用10%甲醛溶液固定肝組織，常規石蠟包埋，4～6 μm 切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.6.3 指標檢測 按照試劑盒說明檢測血清中ALT、AST、ALB水平及肝組織中總蛋白TP、MDA、SOD、GSH-Px和Hyp含量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。所有數據均用（x±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，LSD檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義，P< 0.01，P<0.001 表示差異具有高度統計學意義。

2 結果與分析

2.1 一般狀態 空白對照組小鼠體重增長，毛發光滑且致密，行動敏捷，二便正常。模型組小鼠食欲下降，體重增長較正常組緩慢，且精神萎靡不振，易怒易斗，毛發色澤暗淡紊亂，大便較稀，腹部脹氣。秋水仙堿組體重增長較正常組緩慢。小分子肽低、高劑量組生長情況基本正常，體重增長介于正常組與模型組之間，毛發有光澤，行動如常。實驗過程有動物死亡。

2.2 小鼠肝臟大體及病理學檢測 空白對照組小鼠肝臟質地柔軟，表面光滑且邊緣銳利多呈紅褐色，模型組小鼠肝臟質地較硬，表面油膩且外觀有明顯腫脹，顏色暗淡多呈土黃色，表面有顆粒結節狀突起。小分子肽低、高劑量組肝臟外觀接近正常組，表面鮮有顆粒結節狀突起。

空白對照組肝細胞索排列整齊有序，中央靜脈外肝細胞散發排列整齊，肝細胞無損傷，肝小葉結構無缺失，無炎癥細胞浸潤。模型組肝細胞索排列紊亂，肝細胞壞死且擁擠成團，肝小葉結構破壞，大量炎癥細胞浸潤，說明肝纖維化造模成功。秋水仙堿組肝細胞索排列整齊，肝細胞大多完整，肝小葉完整。小分子肽低劑量組偶爾可見肝小葉中央靜脈缺失，肝索排列較清晰完整。小分子肽高劑量組肝小葉結構完整，肝細胞清晰完整。秋水仙堿與小分子肽低、高劑量均對小鼠肝纖維化癥狀有改善效果。各組小鼠肝組織切片HE染色情況見圖1。

2.3 對血清指標的影響 與空白對照組相比，模型組的AST和ALT水平均顯著升高，表明小鼠肝纖維化模型造模成功;與模型組相比，秋水仙堿和小分子肽低、高劑量組的AST和ALT水平均顯著降低（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.001）。結果見表1。

2.4 對肝組織MDA、GSH-Px、SOD、Hyp的影響 與空白對照組相比，模型組的MDA與Hyp水平均不同程度升高，SOD與GSH-Px水平均顯著降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，秋水仙堿和小分子肽低、高劑量組的MDA和Hyp水平均降低，SOD與GSH-Px含量均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

3 討論

肝纖維化的主要特征是細胞外基質沉積，CCl4是廣泛使用的致小鼠肝纖維化的一種經典造模試劑[22]。肝纖維化水平常用指標以病理組織切片檢查和反映膠原代謝的指標肝組織Hyp含量為主[23]。血清ALT、AST水平是反映肝功能的重要生化指標。CCl4刺激誘發氧化應激和脂質過氧化反應，MDA、SOD和GSH-Px水平從不同角度反映機體抗氧化能力，三者常共同檢測[24]。

本實驗以肝纖維化小鼠為模型，對小分子肽LK-5的抗肝纖維化作用進行了初步研究。模型組小鼠肝臟外觀腫脹，血清ALT、AST水平及肝組織Hyp含量均顯著上升，說明肝功能受損，提示造模成功。給予小分子肽LK-5，邊造模邊給藥，結果表明小分子肽組小鼠的肝功能指標得到改善，ALT、AST、Hyp、MDA含量降低，SOD、GSH-Px的含量均顯著上升，提示提高了機體的抗氧化水平，減輕肝細胞的氧化應激，改善了肝細胞所受破壞，對肝臟產生了一定的保護作用[25]。

近年來肝內RAS系統與肝纖維化疾病的相互關系愈來愈受到重視，鱉甲煎口服液被證實對肝纖維化大鼠的ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang（l-7）-Mas軸產生調節作用，從而抑制肝纖維化病變[26]。本實驗表明具有ACE抑制活性的小分子肽LK-5對肝纖維小鼠具有一定的保護作用，可能與抑制脂質過氧化反應、增強肝臟抗氧化能力有關，其是否與肝內RAS系統相關有待進一步研究。

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（收稿日期：2021-01-13 編輯：劉 斌）

基金項目：國家自然科學基金地區科學基金（81960698）;2017 年廣西中醫藥大學青年基金項目（2017QN011），中藥學一流學科（桂教科研[2018]12號）;廣西中醫藥大學藥學院中藥學學科青年教師提升計劃（050170035）;廣西中醫藥大學 2020 年自治區級大學生創新創業訓練計劃（202010600087）。

作者簡介：廖彭瑩（1984-），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥化學、天然藥物化學。E-mail： gxlpy@163.com