基于InDel標記的新疆色素辣椒遺傳多樣性及聚類分析

李輝玲 張國儒 曾衛東 賽買提江?艾依提 王國洪 張建文

摘要：利用雜種優勢的方式有效提高作物產量和品質的先決條件是全面系統地掌握色素辣椒親本的遺傳背景，包括遺傳差異、遺傳距離等，從而可預見性地選育高產高抗雜交種。利用240對InDel引物對30份新疆色素辣椒地方材料的基因組DNA進行PCR擴增，利用軟件Ntsys 2.10對電泳后的多態性條帶進行聚類分析。本研究最終檢測出23對特異性引物，將參試材料分為3類，有效區分出不同品種資源間基因的內部差異。InDel分子標記技術系統地評價了各資源間的遺傳距離和親緣關系情況，為雜交育種工作中選配親本提供了一定的理論參考和指導。

關鍵詞：色素辣椒;遺傳多樣性;InDel分子標記;聚類分析;雜交組合

中圖分類號：S641.303?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0067-04

收稿日期：2021-01-07

基金項目：巴音郭楞蒙古自治州財政支持基本科研業務經費（編號：202008、202104）。

作者簡介：李輝玲（1988—），女，甘肅蘭州人，碩士，助理研究員，主要從事特色作物的育種與栽培。E-mail：12354399@qq.com。

通信作者：張建文，碩士，副研究員，主要從事加工番茄、色素辣椒等作物的育種與栽培。E-mail：1220743143@qq.com。

辣椒屬于茄科（Solanaceae），是全球第三大作物，隨著栽培面積的不斷擴大，辣椒產業發展速度迅猛，逐漸成為我國最大的蔬菜產業[1-2]。用于工業萃取辣椒紅色素的辣椒即色素辣椒，20世紀90年代初，新疆開始大范圍、規?；N植色素辣椒，因其紅色素含量和產量高且病蟲害少而被國際市場青睞，成為新疆“紅色產業”重要組成之一[3]。色素辣椒新品種選育的過程包括自交系選擇、雜交試配和品種比較試驗等，其中，雜種優勢利用是色素辣椒新品種選育的重要途徑[4]，而試配親本的親緣關系是重要指標。傳統育種通常依據田間作物的直觀表型性狀來分析親緣關系的遠近，譬如生產中關鍵的經濟指標——產量，是育種中判斷新品種雜種優勢的重要標準[5]，屬于數量性狀遺傳，受環境影響大，通過表型性狀選擇的效率低。分子標記技術可以使育種者在作物幼苗期、DNA層面上了解各個材料的遺傳距離和親緣關系，快速準確地鑒定出遺傳差異。

分子標記技術常用于育種工作中對作物資源的遺傳多樣性及遺傳背景、遺傳距離的研究?；谌蚪M的分子標記在辣椒中已有應用，但利用InDel標記對新疆色素辣椒種質資源遺傳分析和聚類研究的報道較少。插入缺失長度多態性（insertion-deletion length polymorphism，InDel）是近緣種或同一物種不同個體間基因組DNA插入或缺失部分核苷酸的現象，即同源的序列相比，某一個位點有插入或缺失部分堿基的情況[6]。InDel標記作為新一代分子標記[7]，在基因組中分布廣泛、數量眾多，多應用于分子輔助育種、動植物群體遺傳分析等相關研究[8-10]。借助InDel分子標記技術分析種質資源的遺傳多樣性，有助于優異品質性狀的改良[11]。本研究采用240對InDel引物對30份地方色素辣椒資源進行遺傳多樣性分析評價，快速準確地判斷材料間的遺傳距離，為后續色素辣椒育種中雜交親本選配及品種遺傳改良提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的30份試驗材料（表1）均由巴音郭楞蒙古自治州農業科學研究院特色作物研究室辣椒課題組提供，其中有本課題組培育的品種（新椒29號）、保存的部分高代自交系材料和其他地區收集的材料（共7份），于2020年10月在人工氣候室播種育苗，每份材料育苗40株。

1.2 方法

1.2.1 辣椒DNA提取

每份材料隨機采集約 100 mg 新鮮嫩葉，置于1.5 mL試管中，放入2粒鋼珠，經液氮處理后，采用高通量組織研磨器進行破碎研磨。按照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒（目錄號：DP320）步驟提取各材料的基因組DNA。采用核酸檢測儀（NanoDrop-1000）及1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行純度、濃度檢測，采用凝膠成像系統拍照記錄，并將提取的DNA原液于 -20 ℃ 冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴增

PCR反應體系（總體積10 μL）：模板DNA 3.5 ng/μL、上下游引物0.5 μmol/L和 2×Taq PCR Mix 5.0 μL。

擴增反應程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環;72 ℃延伸5 min;所得產物4 ℃冰箱保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠、北京六一電泳儀廠的DYY-12型電泳儀（200 V，400 mA，100 W，60 min），銀染法顯色后在醫用膠片觀察燈上，觀察并用數碼相機拍照。

1.2.4 數據處理

對擴增后的條帶進行帶型統計分析，根據帶型構建（0，1）矩陣（0代表無條帶，1代表有條帶）存入Excel表格中[12-13]。利用Ntsys 2.10軟件計算30份地方資源的遺傳相似系數，按照非加權配對算數平均法（UPGMA）進行聚類分析[14]，繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 DNA模板的檢測

由圖1可知，圖譜中條帶整齊清晰未見拖尾，樣品間濃度較為均勻，所提DNA質量測定值D260 nm/D280 nm的比值位于1.8～2.0，濃度在237～92 ng/μL。結果表明，提取的DNA純度高并且結構完整，可以稀釋一定比例后用于后續InDel-PCR分析。

2.2 InDel引物多態性分析

隨機挑選8個色素辣椒基因組DNA組成小群體，對240對InDel引物進行擴增，淘汰效果欠佳、帶型不好辨認的引物，篩選出23對引物（表2）。由圖2可知，30份材料有特異性條帶，特異性檢出率為9.58%。由表3可知，共擴增出166條帶，多態性帶71條，多態性比率為42.8%。

2.3 聚類結果

采用Ntsys 2.10軟件對擴增的結果進行分析，計算30份色素辣椒材料之間的遺傳相似系數。結果表明，各材料之間的遺傳相似系數在0.24～1.00間，供試30份色素辣椒種質資源總體表現遺傳差異較小，遺傳基礎狹窄。對30份色素辣椒材料進行UPGMA聚類分析，由圖3可知，在遺傳相似系數0.64處將30份地方色素辣椒材料分為3個類群，其中，第一類群包含13份材料，分別為1、10、2、15、16、 17、5、6、11、18、41、12、37; 第二類群包含8份材料，分別為8、32、20、21、35、22、33、9;第三類群包含9份材料，分別為4、28、36、13、14、34、7、38、19。

3 討論與結論

中國辣椒萃取工業發展迅猛，在世界辣椒紅產量和辣椒規?；a市場中占據很大份額[15-17]。色素辣椒國際貿易定價中，色價是決定性關鍵指標[16]，高色價是色素辣椒選育的重要目標，高色價品種會給農戶和辣椒紅色素萃取工業帶來更加豐厚的利潤回報。近年來，辣椒種植規模不斷擴大，引進品種和地方品種混雜無據、自留種連年退化等現狀直接影響辣椒紅色素產業的整體穩步、 持續健康發展，用遺傳多樣性對辣椒種質資源進行分析評價并輔助雜交育種的親本選配尤為重要。鑒于此，本研究搜集了30份色素辣椒材料，采用InDel分子標記技術進行遺傳相似性與聚類分析，聚類分析是品種遺傳背景差異度評價工作中廣泛使用的技術手段[18-21]，本試驗的目的是對現有的地方色素辣椒材料進行客觀評估，為今后色素辣椒育種提供參考依據和指導。

本研究從240對引物中篩選出有特異性條帶的引物23對，通過對30份色素辣椒材料進行擴增，最終將30份材料分為3個類群，通過表型性狀比對發現，每個類群均有相似或相近的特點。試驗中篩選得出的23對引物能夠有效區分材料之間的差異，在DNA分子層面評價了地方色素辣椒品種間的遺傳多樣性和遺傳背景差異，此結果為今后色素辣椒種質的搜集、利用和遺傳改良提供一定的理論基礎并對生產實踐有一定的指導意義。

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