單環刺螠體壁制備海鮮調味基料的工藝研究

付雪媛 孫呈浩 王長偉 杜芬 李八方

摘要 [目的]篩選單環刺螠體壁制備海鮮調味基料的最佳工藝。[方法]以單環刺螠體壁為原料，將物理抽提法與酶解法相結合制備海鮮調味基料，分析單環刺螠體壁的基本營養成分、氨基酸組成，并采用單因素試驗和正交試驗優化酶解工藝。[結果]采用風味蛋白酶進行酶解，最優酶解工藝條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解時間5 h。在該條件下蛋白水解度為38.23%，所得酶解液風味較好、分子量較低。[結論]將酶解液過濾后與蒸煮所得上清液復合即得到鮮味濃郁、營養豐富的單環刺螠海鮮調味基料，可用于進一步復配加工成相關海鮮調味料。

關鍵詞 單環刺螠;營養評價;酶解;水解度;海鮮調味基料

中圖分類號 TS 254? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）18-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.041

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Technology Research of Preparation of Seafood Flavor Condiment Base from Urechis unicinctus Body Wall

FU Xue-yuan1，SUN Cheng-hao2，WANG Chang-wei1 et al （1.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao，Qingdao，Shandong 266071;2.PONY （Qingdao） Testing International Group Co.，Ltd，Qingdao，Shandong 266061）

Abstract [Objective]To select the best process for preparing seafood flavouring base from single Unicinctus unicinctus body walls.[Method] The physical extraction and enzymatic hydrolysis was combined to prepare seafood flavor condiment base from Urechis unicinctus body wall.The basic nutritional composition，amino acid composition of urechis unicinctus body wall were analyzed;the parameters of enzymolysis were optimized through single factor experiment and orthogonal experiment.[Result] Flavor protease was adopted in the progress of enzymatic hydrolysis，the optimal conditions were as follows：the enzymolysis temperature was 50℃，the solid-liquid ratio was 1∶4，the dosage of enzyme was 7 000 U/g，the enzymolysis time was 5 h，under these conditions，the degree of hydrolysis was 38.23%，the obtained enzymatic hydrolysate has better flavor and lower molecular weight.[Conclusion]The filtered enzymatic hydrolysate will be combined with the supernatant after boiled，and this combined liquid was Urechis unicinctus seafood flavor condiment base，which was rich in nutrients and umami flavor and can be used for further compounding and processing to related seafood seasonings.

Key words Urechis unicinctus;Nutrition evaluation;Enzymatic hydrolysis;Degree of hydrolysis;Seafood flavor condiment base

基金項目

國家自然科學基金青年科學基金項目（51703214） 。

作者簡介 付雪媛（1990—），女，山西陽泉人，工程師，碩士，從事海洋水產品高值化利用研究。*通信作者，教授，博士，博士生導師，從事海洋功能制品研究。

收稿日期 2021-02-19

單環刺螠（Urechis unicinctus），俗稱海腸，隸屬螠蟲動物門，主要分布于中國、俄羅斯、日本、朝鮮沿海地區的泥潭或巖石縫中[1]，其營養成分接近海參，因此被譽為裸體海參[2]。單環刺螠營養價值豐富，體壁占總質量的32%左右，含有豐富的蛋白質[3]，氨基酸組成合理，含有多種必需氨基酸。生物活性肽、纖溶酶等含量豐富[4]，呈味氨基酸含量豐富[5]，味道鮮美，是制作海鮮調味料的良好材料。

目前市面上常見的海鮮調味料有魚露、蝦油、耗油等，主要以魚、蝦、貝類為原料，經過抽提、分解、加熱、濃縮等工藝[6]，使天然鮮味釋放。根據加工方式不同，調味料分為分解型、抽提型和反應型[7]。分解型調味料是通過加酸、加酶、發酵等方式將原料分解，形成富含氨基酸、多肽、有機酸的調味液[8-10];抽提型海鮮調味料是經過抽提、分離、混合等產生鮮味濃郁的天然浸出物，常用方法有水提法、醇提法[11];反應型調味料是通過氨基酸和糖類的美拉德反應制備天然香基，再經調配后得到成品調味料[12-13]。

有學者對以單環刺螠為原料制備海鮮調味料進行研究和開發。在李新民[14]的研究中，將海腸烘烤、粉碎得到海腸粉，經復配得到海腸調味料;劉海梅等[15]采用復合風味蛋白酶或木瓜蛋白酶直接酶解海腸，改善了水解液風味;王思婷等[16]通過風味蛋白酶酶解海腸，再經噴霧干燥制得海腸調味顆粒。該研究創新了提取工藝，將物理抽提法與加酶分解法相結合，研究了酶解工藝條件和工藝參數，所得調味液基料滋味鮮美，既保留了海腸原始風味，又進一步釋放鮮味成分，可用于加工成單環刺

螠調味料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮單環刺螠：購自青島麥島海鮮水產市場;中性蛋白酶（130 000 U/g）、堿性蛋白酶（220 000 U/g）、風味蛋白酶（130 000 U/g）、胰蛋白酶（350 000 U/g）、復合蛋白酶（52 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司，食品級;石油醚、甲醛、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司，分析純;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司;L-8900型氨基酸自動分析儀，日本日立公司;SKD-100型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司;QSJ-B03E1型料理機，廣東小熊電器有限公司;HWS24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司;SHA-C型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;BSA2202S型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;PH400型pH計，安萊立思儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單環刺螠基本營養成分分析。

水分：參照GB/T 5009.3—2016，直接干燥法測定;灰分：參照 GB/T 5009.4—2016，灼燒法測定;蛋白質：參照GB/T 5009.5—2016，半微量凱氏定氮法測定;總脂：參照GB/T 5009.6—2016，索氏抽提法測定。

1.3.2 氨基酸組成分析。

參照GB/T 5009.124—2016食品中氨基酸的測定。采用氨基酸自動分析儀測定，855-4506型離子交換柱（4.6 mm×60.0mm），柱溫57 ℃，泵流速0.4 mL/min，進樣體積20 μL，分析時間50 min。

1.3.3 分子量分析。

參照GB 31645—2018進行測定。采用高效液相色譜法，TSK GEL G2000SWXL色譜柱，柱溫30 ℃，體積流量0.8 mL/min，流動相為體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸混合溶液，檢測波長220 nm，結果通過GPC軟件進行分析。

1.3.4 單環刺螠體壁海鮮基料的制備工藝。將單環刺螠體壁置于攪碎機攪碎→調整料液比為1∶2→小火煮沸蒸煮2 h→過濾得上清備用→剩余固體冷卻后調整料液比→調節pH→加酶恒溫酶解→滅酶→冷卻→過濾得上清液→與蒸煮上清液合并→單環刺螠體壁海鮮基料。

1.3.5 酶解單因素試驗。

在固定其余因素不變的情況下，分別考察料液比、酶解溫度（℃）、酶解時間（h）、加酶量（U/g）對蛋白質水解度的影響，以此數據作為正交試驗設計的依據。

1.3.6 酶解正交試驗。

在單因素試驗的基礎上，采用風味蛋白酶，固定酶解液pH為7.5，選擇酶解料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度為因素，以蛋白質水解度為試驗指標，進行4因素3水平正交優化試驗。因素水平設計見表1。

1.3.7 蛋白質回收率與水解度測定。

參照GB/T 6432—2018，采用凱氏定氮法測定原料和酶解液中總氮含量;參照GB 5009.235—2016，中性甲醛滴定法測定游離氨基態氮含量。

蛋白質回收率（%）=水解液總氮含量/原料總氮含量 ×100;蛋白質水解度（%）=水解液游離氨基態含量/水解液總氮含量×100

1.4 數據分析

對所有數據利用SPSS18.0統計軟件進行處理，多組數據之間統計學差異采用單因素方差分析，P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單環刺螠體壁基本營養成分

由表2可知，單環刺螠體壁水分含量為82.70%，蛋白質含量為12.63%，總脂含量為1.55%，灰分含量為2.22%，其中蛋白質含量占干重的71.01%，含量豐富。

2.2 單環刺螠體壁氨基酸

通過檢測18種氨基酸，單環刺螠體壁的氨基酸組成見表3。單環刺螠體壁中谷氨酸含量為非必需氨基酸最高，達到9.81%，其次為甘氨酸（8.86%）、丙氨酸（8.20%），色氨酸未檢測出。谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸等均為重要的呈味氨基酸，其總和占氨基酸總量比例（DAA/TAA）達到57.35%，這可能是單環刺螠味道鮮美的原因所在。FAO/WHO的理想模式認為，EAA/TAA接近40%營養價值較好。單環刺螠體壁的EAA/TAA為31.17%，較為接近FAO/WHO的標準。

必需氨基酸評分結果見表4。8種必需氨基酸的含量及構成比例是評價蛋白質營養價值的依據，通常以FAO/WHO推薦的EAA模式和蛋氨酸模式進行參比。單環刺螠體壁檢測出7種必需氨基酸，其中蘇氨酸的AAS評分最高，為1.18，蛋氨酸+胱氨酸的AAS評分最低，為0.52，其余各項氨基酸評分均接近1.00，說明單環刺螠體壁必需氨基酸結構較為合理，基本符合人體對必需氨基酸的需求，具有較高的營養價值。

2.3 酶種類篩選

比較風味蛋白酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對酶解效果的影響，酶解參數見表5。以蒸煮后剩余固體為原料進行酶解，以氮收率和水解度為考察指標，結果見圖1。5種蛋白酶中，胰蛋白酶和風味蛋白酶酶解后氮收率分別達到63.10%和61.08%，兩者無顯著性差異，但顯著高于復合蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶;風味蛋白酶酶解后水解度達到33.25%，顯著高于其他4種酶。鑒于風味蛋白酶酶解后氮收率和水解度較高，且酶解液風味較好，因此選擇風味蛋白酶為最適宜水解酶。

2.4 酶解單因素試驗

2.4.1 不同料液比對水解度的影響。

固定提取溫度50 ℃，提取時間4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同料液比對蛋白水解度的影響，結果見圖2。從圖2可見，在料液比為1∶3時，水解度達到最高水平，為30.66%。隨著加水量增加，水解度呈下降趨勢，原因可能是酶濃度降低，難以充分與單環刺螠蛋白接觸，從而難以充分酶解。因此，選擇料液比為1∶3作為酶解提取的適宜條件。

2.4.2 不同酶解溫度對水解度的影響。

固定料液比1∶3，提取時間4 h，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解溫度對水解度的影響，結果見圖3。從圖3可見，隨著酶解溫度的升高，蛋白水解度不斷增大，到50 ℃時水解度最高，達到31.50%，當酶解溫度繼續升高至60 ℃時，水解度下降至29.10%。溫度升高時，酶和底物的分子擴散運動加快，結合速率提高，因此使得水解度不斷升高，當達到一定溫度后繼續升高溫度時，酶活力下降，水解度降低，因此選擇50 ℃作為風味蛋白酶酶解的適宜溫度。

2.4.3 不同酶解時間對水解度的影響。固定料液比1∶3，提取溫度50 ℃，加酶量7 000 U/g，研究不同酶解時間對蛋白水解度的影響，結果見圖4。從圖4可見，在3～6 h，隨著酶解時間的延長，水解度不斷上升，到6 h時水解度達到32.22%。隨著酶解時間的進一步延長，水解度呈下降趨勢。過長水解時間可能導致蛋白過度水解產生苦味肽，且提高制備成本。因此，選擇6 h作為最佳酶解時間。

2.4.4 不同加酶量對水解度的影響。

固定料液比1∶3，提取溫度50 ℃，酶解時間4 h，研究不同加酶量對水解度的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著加酶量的增加，水解度不斷上升。當加酶量為7 000 U/g時，水解度達到32.75%，加酶量繼續增加，水解度反而下降，當加酶量為11 000 U/g時，水解度為30.67%。這是由于當酶濃度過高時酶與底物接觸已經飽和，不會再提高水解效率。因此，選擇7 000 U/g作為單環刺螠體壁酶解的適宜加酶量。

2.5 酶解正交優化試驗 在單因素試驗的基礎上，采用風味蛋白酶，固定酶解液pH為7.0，選擇酶解料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度為因素，以水解度為試驗指標，進行4因素3水平正交優化試驗，結果見表6。由表6可知，風味蛋白酶酶解單環刺螠體壁過程中，各因素對水解度的影響從大到小依次為料液比、酶解溫度、酶解時間、加酶量。最佳酶解條件組合為料液比1∶4，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h，加酶量7 000 U/g。在該試驗條件下進行驗證試驗，平行3次，水解度為（38.23±1.32）%，優于最大值38.11%。

2.6 分子量測定 采用液相色譜法分別測定酶解液和酶解前單環刺螠體壁固體分子量，分子量分布見圖6。酶解前單環刺螠體壁蛋白質平均分子量為1 886 Da，酶解后分子量為637Da，說明在該試驗條件下，風味蛋白酶能夠將大分子蛋白質切割為小分子肽段或游離氨基酸，酶解效果顯著。

3 結論

該研究以單環刺螠為原料進行基本營養成分分析及氨基酸分析，結果表明，單環刺螠具有高蛋白、低脂肪的營養特點，氨基酸含量豐富，其中必需氨基酸占比達31.17%，呈味氨基酸占比達57.35%，說明單環刺螠不僅營養豐富且味道鮮美，可以作為海鮮調味料的原料進行開發。

將抽提法與酶解法的工藝條件結合，經蒸煮抽提后的單環刺螠體壁進一步酶解，確定風味蛋白酶作為最適宜水解酶，經過單因素試驗和正交試驗確定最適酶解條件，當酶解條件為酶解溫度50 ℃、料液比1∶4、加酶量7 000 U/g、酶解時間5 h時，蛋白水解度最高，為38.23%，且酶解液分子量較低，利于人體吸收;所得的酶解液經過濾后與前期蒸煮過濾得到的上清液合并（為增強基料鮮味的渾厚感）即為單環刺螠海鮮調味料基料，該基料風味鮮美、澄清、無苦味，可用于進一步加工復配成海鮮調味料。該研究為單環刺螠海鮮調味料的開發提供了理論依據。

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