基于氣味信息的荊芥穗產地鑒別

張禮欣 于小聰 王澤琨 毛春琴 束雅春

中圖分類號 R282.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）18-2203-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.05

摘 要 目的：建立基于氣味信息的不同產地荊芥穗的鑒別方法。方法：采用Heracles Ⅱ型超快速氣相電子鼻技術對不同產地荊芥穗進行氣味鑒別，根據獲取的圖譜信息結合AroChemBase數據庫、Kovates保留指數定性庫進行定性分析;采用Alpha Soft V14.2軟件進行主成分分析（PCA）、判別因子分析（DFA）;采用SPSS 22.2軟件進行聚類分析（CA）。結果：15批不同產地荊芥穗中共有16個共有峰，經與AroChemBase數據庫、Kovates保留指數定性庫對比，共得到13個可能存在的成分。不同產地荊芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，僅含量存在差別。2號共有峰的色譜峰強度為安徽>甘肅>河南>河北>江蘇;6號共有峰的色譜峰強度為安徽>河北>甘肅≈河南>江蘇;9號共有峰的色譜峰強度為安徽>甘肅>河南>江蘇>河北;13號共有峰的色譜峰強度為安徽≈甘肅>河北>江蘇>河南，即代表甲酸甲酯（2號）、α-蒎烯（6號）、3-壬酮（9號）及α-松油醇（13號）這4種成分的色譜峰強度可因產地變化而存在較為顯著的差異。 PCA結果顯示，前2個主成分的累計貢獻率為96.807%。DFA結果顯示，判別因子1和判別因子2的貢獻率分別為92.089%和3.982%。CA結果顯示，當距離為10時，15批樣品可聚為3類，B1～B5、J1～J3聚為一類，A1～A3聚為一類，G1、G2、N1、N2聚為一類，與 PCA、DFA結果基本一致。結論：超快速氣相電子鼻技術可用于鑒別不同產地的荊芥穗;甲酸甲酯、α-蒎烯、3-壬酮及α-松油醇可能為區分不同產地荊芥穗的關鍵因素。

關鍵詞 超快速氣相電子鼻技術;荊芥穗;不同產地;化學計量學;氣味鑒別

Identification of the Origin of Schizonepeta tenusfolia Based on “Odor” Information

ZHANG Lixin1，YU Xiaocong1，WANG Zekun1，MAO Chunqin2，SHU Yachun1，2（1. Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM， Nanjing 210029， China; 2. School of Pharmacy， Nanjing University of TCM， Nanjing 210023， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for identifying Schizonepeta tenusfolia from different habitats based on odor information. METHODS： The odor of S. tenusfolia from different habitats were identified by Heracles Ⅱ ultra-fast gas phase electronic nose. Qualitative analysis was conducted according to obtained chromatographic information combined with AroChemBase database and Kovats retention index qualitative database. Principle component analysis （PCA） and discriminant factor analysis （DFA） were conducted by using Alpha Soft V14.2 software， and cluster analysis （CA） was performed with SPSS 22.2 software. RESULTS： There were 16 common peaks in 15 batches of S. tenusfolia from different habitats. After comparison with AroChemBase database and Kovates retention index qualitative database， a total of 13 possible components were obtained. The possible components and sensory description information of S. tenusfolia from different habitats were basically the same， but only the content was different. The chromatographic peak intensities of common peak No. 2 were in descending order as Anhui > Gansu>Henan>Hebei>Jiangsu， the chromatographic peak intensities of common peak No. 6 were in descending order as Anhui>Hebei>Gansu≈Henan>Jiangsu， the chromatographic peak intensities of common peak No. 9 were in descending order as Anhui>Gansu>Henan>Jiangsu>Hebei， the chromatographic peak intensity of common peak No. 13 were in descending order as Anhui≈Gansu>Hebei>Jiangsu>Henan， which represented the chromatographic peak intensity of methyl formate （peak No. 2）， α-pinene （peak No. 6）， 3-nonone （peak No. 9） and α-terpineol （peak No. 13） were significantly different due to the change of habitats. PCA results showed that the cumulative contribution rate of the first two principal components was 96.807%. Results of DFA showed that contribution rates of discriminant factor 1 and discriminant factor 2 were 92.089% and 3.982%. CA results showed that when the distance was 10， 15 batches of samples could be clustered into 3 categories， B1-B5 and J1-J3 into one category， A1-A3 into one category， G1， G2， N1 and N2 into one category. The results were basically consistent with those of PCA and DFA. CONCLUSIONS： Ultra-fast gas phase electronic nose technology can be used to identify S. tenusfolia from different habitats rapidly. Methyl formate， α-pinene， 3-nonone and α-terpineol may be the key factors to distinguish S. tenusfolia from different habitats.

KEYWORDS? ?Ultra-fast gas phase electronic nose; Schizone- petae tenusfolia; Different habitats; Chemometrics; Odor identification

荊芥穗為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥花穗，為臨床常用解表藥[1]。該藥主產于我國江蘇、河北、江西等地，其主要化學成分包括揮發油、黃酮、有機酸等[2-5]?，F代藥理研究表明，荊芥穗具有抗炎、抗病毒、抗補體和抑制腫瘤細胞增殖等作用[6-7]，常用于感冒頭痛、咽喉腫痛及多種皮膚疾病的治療[8]?，F階段關于荊芥穗的研究多側重于其種質資源、揮發油的種類及成分分析、化學成分的提取等，常結合高效液相色譜法（HPLC）、氣質聯用法（GC-MS）和擴增片段長度多態性（AFLP）標記等技術對其進行分析[2-4，9]。這些分析方法雖可準確區分不同產地的荊芥穗，但具有樣品預處理復雜、過程繁瑣、成本高等缺點[10-11]。因此，探尋一種準確客觀、簡單快速鑒別不同產地荊芥穗的新方法具有重要的實際意義。

《新修本草》云：“離其本土，則質同而效異”[12]。自古以來醫家用藥就十分重視藥材產地，產地不同則質量不一，飲片質量及臨床療效難以保證[13]。有研究指出，“氣味”特征與其內在化學成分密切相關，尤其是一些含揮發油的藥材，氣味明顯則藥效更佳，如荊芥穗以“色淡黃綠、穗長而密、香氣濃、味清涼者為佳”[14]?？梢?，氣味體現了中藥材整體性的特點[15]。但人為感官評價因受感官差異和環境的影響，其客觀性和準確性難以保證。因此，亟需尋找一種可對氣味進行客觀評價的方法，以實現中藥的快速、準確鑒別。電子鼻是近年快速興起的一種能夠全面客觀識別中藥整體氣味信息的智能感官儀器，電子鼻技術目前已在中藥真偽、產地、采收期及炮制品判別等中藥領域中得以廣泛應用，能較全面、完整、客觀地反映中藥材的整體氣味特征[16-23]。例如，牟倩倩等[16]采用電子鼻技術結合化學計量學方法實現了對南北五味子品種的快速鑒別;劉立軒等[17]采用電子鼻技術建立了不同產地秦艽的鑒別方法;盧一等[18]采用超快速氣相電子鼻技術建立了硫熏麥冬與未硫熏麥冬的快速鑒別方法?；诖?，本研究采用超快速氣相電子鼻技術獲取荊芥穗“氣味指紋”信息，建立氣味指紋圖譜，同時結合主成分分析（PCA）、判別因子分析（DFA）、聚類分析（CA）等化學計量學方法對不同產地荊芥穗的氣味特征進行分析，使氣味成為可量化的指標，以期為不同產地荊芥穗的快速鑒別提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Heracles Ⅱ型超快速氣相電子鼻以及配套的火焰離子化檢測儀、AroChemBase數據庫[Kovates保留指數（RI）定性庫]、Alpha Soft V14.2軟件、HS-100型自動進樣器（法國Alpha MOS公司），HL-350型高速多功能粉碎機（上海塞耐機械有限公司），FA1104N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

正構烷烴（nC6～nC16）混合對照品（批號A0142930，每100 g混合物中含nC6～nC16共0.02～52.27 g）購自美國Restek公司。

15批荊芥穗飲片均購自河北、安徽、河南等地中藥材市場，經南京中醫藥大學陸兔林教授鑒定為唇形科植物荊芥S. tenuifolia Briq.的干燥花穗。將15批荊芥穗樣品粉碎，過二號篩，備用。15批荊芥穗飲片信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 單因素考察

HeraclesⅡ型超快速氣相電子鼻為頂空進樣裝置，當檢測條件不同時，所得色譜圖可能存在較大差異[21]。為使電子鼻具有良好的分析效果，本研究參考相關文獻[18，21-22]，分別對進樣量、孵化溫度和孵化時間進行單因素考察，以確定最優的檢測條件。

2.1.1 進樣量 取荊芥穗樣品（編號A1）粉末，精密稱取0.5 g，設置孵化溫度40 ℃、孵化時間20 min，考察不同進樣量（500、1 000、1 500、2 000、2 500 ?L）對樣品色譜峰峰面積及峰形的影響。結果顯示，隨著進樣量增加，樣品峰面積逐漸增大;當進樣量增至2 000 ?L時，所得色譜峰峰形適中，故選擇進樣量為2 000 ?L。

2.1.2 孵化溫度 取荊芥穗樣品（編號A1）粉末，精密稱取0.5 g，設置進樣量2 000 ?L、孵化時間20 min，考察不同孵化溫度（40、45、50、55、60 ℃）對樣品色譜峰峰面積及峰形的影響。結果顯示，當孵化溫度為50 ℃時，所得色譜峰峰形良好;若繼續升高溫度，部分色譜峰峰高先增加后減小，且孵化溫度過高可對荊芥穗中的氣味成分造成一定損耗或由于分離效果不好導致實驗結果差異，故選擇孵化溫度為50 ℃。

2.1.3 孵化時間 取荊芥穗樣品（編號A1）粉末，精密稱取0.5 g，設置進樣量2 000 ?L、孵化溫度50 ℃，考察不同孵化時間（10、15、20、25、30 min）對樣品色譜峰峰面積及峰形的影響。結果顯示，當孵化時間為20 min時，所得色譜峰峰形良好，色譜峰峰面積趨于飽和、穩定，故選擇孵化時間為20 min。

2.2 檢測條件

本研究所用的色譜柱為低極性MXT-5（10 m×0.18 mm，0.4 ?m）、中極性MXT-1701（10 m×0.18 mm，0.4 ?m）;樣品瓶為20 mL，樣品量為0.5 g，進樣量為2 000 ?L;孵化溫度為50 ℃，孵化時間為20 min;進樣速度為125 ?L/s，進樣持續時間為21 s;進樣口溫度為200 ℃;捕集阱初始溫度為40 ℃，最終溫度為240 ℃，分流速度為10 mL/min，捕集時間為26 s;柱溫初始溫度為50 ℃，程序升溫（以1 ℃/s升至80 ℃，以5 ℃/s升至100 ℃，再以1 ℃/s升至180 ℃，最后以5 ℃/s升至250 ℃，保持20 s）;采集時間為150 s;火焰離子化檢測儀增益為12。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取荊芥穗樣品（編號A1）粉末約0.5 g，精密稱定，共6份，按“2.2”項下條件進行測定，記錄圖譜，以峰面積最大的峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，16個共有峰相對保留時間的RSD均不高于0.14%（n=6），相對峰面積的RSD均不高于4.99%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取荊芥穗樣品（編號A1），分6次粉碎，每次取粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項下條件進行測定，記錄圖譜，以峰面積最大的峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，16個共有峰相對保留時間的RSD均不高于0.14%（n=6），相對峰面積的RSD均不高于4.86%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取荊芥穗樣品（編號A1）粉末約0.5 g，精密稱定，共6份，分別于溫度（17±3） ℃、濕度（35±5）%條件下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2”項下條件進行測定，記錄圖譜，以峰面積最大的峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，16個共有峰相對保留時間的RSD均不高于0.15%（n=6），相對峰面積的RSD均不高于4.89%（n=6），表明樣品粉末于上述條件下放置24 h內穩定性良好。

2.4 荊芥穗粉末氣味數據分析

分別取15批不同產地荊芥穗樣品粉末，按“2.2”項下條件進行測定。除去空白參考后，記錄15批荊芥穗樣品的圖譜信息。將圖譜導入Origin 2018函數繪圖軟件，建立荊芥穗氣味特征的指紋圖譜，詳見圖1。由圖1可知，不同產地的荊芥穗共有16個共有峰。其中，河北產荊芥穗的氣味信息與其他產地的荊芥穗之間存在較為明顯的差異，故以河北產荊芥穗為對照，隨機選取不同產地的樣品各1批（編號分別B1、A1、G1、N1、J1），采用Macromedia Fireworks 8繪圖軟件繪制鏡像對比圖（圖2），比較兩者對應色譜峰的峰面積變化規律，尋找專屬性差異。采用正構烷烴（nC6-nC16）混合對照品溶液進行校準后，將15批荊芥穗圖譜信息的保留時間（RT）轉換為RI，經AroChemBase數據庫對比得出定性結果，詳見表2。

由圖2、表2可知，16個共有峰經與數據庫對比得到13個可能存在的化合物（表中篩選出的化合物匹配相似度均大于90%）;不同產地荊芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，僅含量存在一定差異。2號共有峰的色譜峰強度為安徽>甘肅>河南>河北>江蘇;6號共有峰的色譜峰強度為安徽>河北>甘肅≈河南>江蘇;9號共有峰的色譜峰強度為安徽>甘肅>河南>江蘇>河北;13號共有峰的色譜峰強度為安徽≈甘肅>河北>江蘇>河南，即代表甲酸甲酯（2號）、α-蒎烯（6號）、3-壬酮（9號）及α-松油醇（13號）這4種成分色譜峰的強度可因產地變化而存在較為顯著的差異，表明這4個色譜峰可能是區分不同產地荊芥穗的關鍵因素。

2.5 PCA

PCA 是把多指標轉化為少數綜合指標的一種多元統計分析方法[24]，其可將所提取的信息進行數據轉換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，最后在分析圖上顯示主要的二維圖[20]。本研究采用超快速氣相電子鼻自帶的Alpha Soft V14.2軟件，將篩選出的區分能力強（>0.900）、峰面積較大（>1 000）且分離度較好的色譜峰作為傳感器進行 PCA[23]。結果顯示，第1主成分（PC1）的貢獻率為88.949%，第2主成分（PC2）的貢獻率為7.858%，兩個主成分的累計貢獻率為96.807%，表明不同產地荊芥穗氣味的差異主要由PC1決定。PCA區分指數（DI）為94（DI是電子鼻區分樣品程度的表征，DI的最大值為100;80～100表明有效區分，且其值越大表示區分越好[25]）。河南、甘肅及安徽產荊芥穗主要分布于PCA圖右邊，江蘇、河北產荊芥穗主要分布于圖左邊;相同產地的樣品分布較為集中，不同產地的樣品離散程度較大，表明不同產地樣品的氣味差異明顯，詳見圖3。

2.6 DFA

DFA是一種用于構建模型并識別未知樣品所屬類別的方法[15]。通過數學變換，DFA能夠使同類組群數據間的差異盡可能縮小，而不同類組群數據間的差異盡可能擴大，以建立數據識別模型[26]。因此，本研究采用超快速氣相電子鼻自帶的Alpha Soft V14.2軟件進行DFA。結果顯示，判別因子1和判別因子2的貢獻率分別為92.089%和3.982%;相同產地樣品間的距離縮小，不同產地樣品間的距離增大，表明不同產地荊芥穗可通過超快速氣相電子鼻進行快速鑒別，且區分效果較好，所得趨勢及結果與PCA結果一致，詳見圖4。

2.7 CA

CA是將數據聚集到不同的類或者簇的一個過程，同一個簇中的對象有很大的相似性，而不同簇的對象有很大的相異性[24]。CA的目標是在相似的基礎上收集數據并分類[27]。本研究參考相關文獻[28-30]，采用SPSS 22.2軟件以13個共有峰峰面積為變量，以平方歐式距離為測度，以組間連接法進行CA。結果顯示，當距離為10時，15批荊芥穗可聚為3類，B1～B5、J1～J3聚為一類，A1～A3聚為一類，G1、G2、N1、N2聚為一類，該結果與 PCA、DFA結果基本一致，詳見圖5。

3 討論

超快速氣相電子鼻作為一種新型的氣味分析儀器，具有檢測靈敏度高和響應時間短等優點[20]。該儀器不僅可將所得色譜峰作為傳感器，而且還可將RT換算成RI，經正構烷烴校準后，通過AroChemBase數據庫進行定性分析[31]。與傳統型電子鼻相比，氣相輸出信號取代了傳統型電子鼻有限的傳感信號，能夠得到更多的化合物信息，同時能夠通過RI的定性分析來獲取一些未知化合物的氣味信息，有助于對其性質的深入研究[32]?；瘜W計量學方法可對所獲取的數據進行客觀分析，不僅可以對多個指標進行統計分析，而且還可將圖譜信息量化，使其可被計算機識別、處理，并以此客觀地反映中藥的質量信息，從而達到全面控制中藥質量的目的[33]。

本研究采用超快速氣相電子鼻技術對不同產地荊芥穗的圖譜數據進行采集，并通過與AroChemBase數據庫對比得到樣品中可能存在的化合物信息。結果顯示，經與數據庫對比，共從16個共有峰中挖掘出13個可能存在的化合物，不同產地荊芥穗可能存在的成分及感官描述信息基本相同，僅含量存在一定的差別;甲酸甲酯、α-蒎烯、3-壬酮及α-松油醇可能為區分不同產地荊芥穗的關鍵因素。同時，本研究還結合PCA、DFA和CA等化學計量學方法對荊芥穗的氣味特征進行研究。PCA結果顯示，PC1的貢獻率為88.949%，PC2的貢獻率為7.858%，兩者的累計貢獻率為96.807%;DFA結果顯示，相同產地樣品間的距離縮小，不同產地樣品間的距離增大;表明PCA和DFA方法可以準確、有效地區分不同產地荊芥穗。CA結果顯示，15批荊芥穗可聚為3類，B1～B5、J1～J3聚為一類，A1～A3聚為一類，G1、G2、N1、N2聚為一類，表明河北產荊芥穗和江蘇產荊芥穗的氣味信息差異較小，甘肅產荊芥穗和河南產荊芥穗的氣味信息差異較小，而安徽產荊芥穗與其他4個產地的荊芥穗氣味信息差異明顯。上述結果提示，PCA、DFA和CA均可對不同產地荊芥穗進行區分，且3種方法的結果基本一致。

由于荊芥穗產地較多，本研究僅收集到部分產地的樣品，故所得研究結果僅表示在當前收集的樣品范圍內，荊芥穗的氣味變化與其產地環境相關，后續還需收集足夠多的具有代表性的不同產地的樣品進行統計分析。此外，在后續研究中，本課題組還將嘗試其他化學計量學方法（如線性判別分析、人工神經網絡等）來優化和完善荊芥穗的產地鑒別模型，以提高模型的鑒別能力，為建立科學的荊芥穗質量控制評價體系提供依據。

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（收稿日期：2021-05-11 修回日期：2021-08-02）

（編輯：陳 宏）