髖關節脫位法聯合液氮冷凍法建立兔早中期創傷性股骨頭壞死動物模型觀察

王禛， 王上增， 余鵬， 游明燦

（1.河南中醫藥大學，河南鄭州 450046；2.河南省中醫院，河南鄭州 450002；3.上海市第二康復醫院，上海 201900；4.鄭州大學第一附屬醫院，河南鄭州 450052）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head）是靜脈堵塞或股骨頭血供的損壞或中斷，最終導致股骨頭細胞死亡，甚至股骨頭塌陷的病理生理過程[1-2]，與髖關節局部的骨、脂肪代謝等因素密切相關，多為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head）或者是股骨頭無菌性壞死（aseptic necrosis of the femoral head），治療難度較大，發病率逐年上升，且致殘率較高。目前，股骨頭壞死病因仍未完全明確，尚缺少有效的治療方法。對于晚期股骨頭壞死患者，骨壞死區域塌陷或骨折時，需要采取髖關節置換的手術方式來獲得更好的療效[3]。除卻病因、疾病進展過程復雜之外，本病也缺乏理想化的動物模型。因此，建立合適的股骨頭壞死動物模型，對于進一步研究股骨頭壞死的合理治療方案具有重要意義，本研究采用髖關節脫位聯合液氮冷凍法建立兔創傷性股骨頭壞死模型，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級4個月齡雄性日本大耳白兔28只，體質量2.0~2.5 kg，購于河南康達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：SCXK（豫）2016-0002。飼養于河南中醫藥大學實驗中心動物房，分籠標準飼料喂養，自由進水，室溫為20~26℃。本動物實驗操作方案已經河南中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會審議批準[IACUC號：20161201]，實驗過程中遵循“3R”原則。

1.2 藥物、試劑與儀器烏拉坦溶液、注射用水合氯醛、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；多聚甲醛溶液（常州市海拓實驗儀器有限公司）。5605-IECX射線機（德國西門子公司）；3.0T Singna HDxt核磁共振（MRI）（美國GE公司）；BH-2光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 兔創傷性股骨頭壞死模型的制備

1.3.1 造模前準備適應性喂養1周后，觀察實驗動物無異常即可開始實驗。所有兔均選擇右側髖關節進行模型制備。用蒸餾水配制20%的烏拉坦溶液對動物進行麻醉，正式制備模型前給所有兔稱質量，每只兔麻醉劑量為5 mL/kg（可視具體情況增加1~2 mL），麻醉方式為耳緣靜脈麻醉。

1.3.2 模型制備麻醉成功后，將兔側臥位固定在操作臺上，備皮。確定切口，暴露股骨頭，尋找體表骨性標志，確定股骨大轉子。沿股骨大轉子內側緣行長約5 cm的弧形手術切口，切開皮膚后，剝離淺筋膜，剝離深筋膜，暴露臀大肌后使用彎鉗鈍性分離臀大肌，顯露并撥開臀中肌，顯露臀小肌與梨狀肌，顯露股骨大轉子。沿大轉子切斷部分梨狀肌肌肉附著，暴露髖關節關節囊，“T”形切開關節囊，內收內旋右下肢。暴露股骨頭，切斷股骨頭圓韌帶，脫位股骨頭，并將股骨頸近端骨膜組織全部切除。

1.3.3 液氮冷凍固定股骨頭，使用一次性無菌棉簽蘸取液氮置于股骨頭負重區，大約停留8 s后撤離，冷凍后使用溫生理鹽水（約40℃）對局部復溫。如此反復操作3次后，使用生理鹽水沖洗關節腔，使用可吸收縫合線依次縫合肌肉、深筋膜、淺筋膜及皮膚?？p合完畢后使用碘伏紗布消毒，消毒后無菌敷料加壓包扎。

1.3.4 造模后處理造模后當天即開始使用20萬IU青霉素鈉肌肉注射預防術后感染，持續使用5 d。造模后定期對手術切口進行清潔換藥，2 d/次。換藥時密切觀察切口愈合情況，直至切口愈合。最終成功造模兔25只。造模后4、8周分別處死12、13只兔。定期觀察造模后兔精神狀態、活動、二便等一般情況。

1.4 兔股骨頭壞死模型評價指標與方法

1.4.1 影像學觀察造模后4、8周分別對兔進行X線攝片觀察股骨頭情況；造模后4、8周分別進行兔雙髖關節MRI檢查觀察雙側股骨頭情況。

1.4.2 組織學觀察使用空氣栓塞法分批處死兔，無菌條件下手術取出右側股骨頭，置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定浸泡24 h后放入EDAT脫鈣液中進行脫鈣。脫鈣成功后，用石蠟切片機對包埋后的股骨頭組織標本進行切片。對切片進行脫蠟和HE染色。最后，應用光學顯微鏡觀察腦組織病理形態，計算空骨陷窩率，計算方法：鏡下隨機選取5個視野，空骨陷窩率=空骨陷窩總計數/骨陷窩總計數。以術后造模側股骨頭組織學表現可見軟骨剝脫、鏡下觀察到空骨陷窩率增加為判斷造模成功的標準。

2 結果

2.1 造模動物一般情況造模過程中因麻醉劑過量致兔死亡2只，因手術時間較長致兔死亡1只，余存活良好。無感染動物病例。造模后2周內，兔精神狀態較術前萎靡，日?；顒訙p少，不活躍，飲食量較術前減少，體質量減輕，二便正常。造模2周后，一般情況較前好轉，但較術前仍欠佳。觀察可得，兔在被抓取時有明顯的懼怕感。造模4周時，造模兔有不同程度的跛行，患肢力量減弱，彈跳無力。造模后8周，造模兔無法彈跳，跛行較前加重，患肢力量明顯減弱。

2.2 造模后兔股骨頭X線表現圖1結果顯示：造模后4周，患側股骨頭表面光整，股骨頭彌漫性骨質疏松，骨小梁稍模糊，出現局限性骨密度增高，骨質硬化，股骨頭周圍骨質變薄。造模后8周，患側間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。

圖1 造模后兔股骨頭X線檢查表現Figure 1 X-ray performance of rabbit femoral head after modeling

2.3 造模后MRI情況圖2結果顯示：造模后4周，雙側髖關節形態可，右側股骨頭負重區軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號，右側髖關節間隙可見少量條片狀液體信號影。造模后8周，雙側髖關節形態尚可，右側股骨頭負重區可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號。

圖2 造模后兔股骨頭MRI檢查情況Figure 2 MRIperformance of rabbit femoral head after modeling

2.4 股骨頭組織學觀察圖3結果顯示：造模后4周，光鏡下可見骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細、部分破裂，呈不規則現象，骨陷窩空虛，骨細胞減少，造血細胞減少，骨小梁周圍骨細胞減少。造模后8周，光鏡下可見骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴重，壞死區空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細胞增多，可見部分壞死骨細胞，骨細胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細胞稀少甚至消失。

圖3 造模后兔股骨頭組織學圖像（HE染色，×200）Figure 3 Histological features of rabbit femoral head after modeling（by HE staining，×200）

造模后8周組織學發現空骨陷窩率增加，為8%~12%，超過正常兔股骨頭軟骨下區空骨陷窩率，符合達到股骨頭壞死的標準，提示造模成功。具體結果見表1。

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

表1 造模后兔股骨頭組織空骨陷窩率Table 1 The rate of empty osseous lacunae in the femoral head after rabbit modeling （±s，%）

時間造模后4周造模后8周兔數（只）12 13空骨陷窩率8.09±3.04 11.85±1.49

3 討論

股骨頭壞死在臨床中是造成患者疼痛，甚至殘疾的重要病因，嚴重影響了患者的生產能力和活動能力[4]。對于股骨頭壞死動物模型的制備，主要以激素型股骨頭壞死、乙醇攝入型股骨頭壞死和創傷性股骨頭壞死為主。目前，激素型、乙醇攝入型股骨頭壞死動物模型制備技術都相對成熟，激素型股骨頭壞死動物模型的制備方法主要有單一激素使用、激素聯合內毒素或動物血清等方法。酒精性股骨頭壞死動物模型的制備方法主要為局部酒精注射方式。創傷性股骨頭壞死近年來在臨床也較多見，其動物模型制備方法主要有外科手術下頭頸部血管結扎、破壞髓內外血供、股骨頸骨折、物理誘導等方式。曲春濤[5]利用導航裝置鉆孔后對鴯鹋行液氮冷凍和射頻加熱交替的方法處理從而獲得創傷性股骨頭壞死動物模型，但是，制作導航裝置會增加實驗費用，加大實驗負擔。Vélez等[6]、Swiontkowski等[7]通過血管結扎、股骨頸骨折等方法來獲得股骨頭壞死模型，這都需要外科手術技術來實現，學習曲線較長，加大實驗難度，且每個人手術技術有差異，重復性一般。Wang等[8]研究發現，不同周期冷凍方法直接影響股骨頭壞死造模效果。液氮冷凍股骨頭壞死具有造模周期短、動物死亡率低的優點，因而成為相對較常采用的創傷性股骨頭壞死造模方法。本實驗方法通過髖關節脫位聯合液氮冷凍股骨頭的造模方法較王江泳等[9]、楊述華等[10]的實驗方法造模成功率高，且更早出現股骨頭壞死；與周正麗[11]的造模方法比較，因加入了兔髖關節MRI對造模結果進行評價，評價方法更加客觀多樣，更具參考性。

本實驗在參照Wen等[12]以及李玉龍[13]的造模方法基礎上，結合髖關節脫位法制備兔創傷性股骨頭壞死動物模型，術中切斷了兔股骨頭圓韌帶、脫位股骨頭后，使用液氮冷凍法直接冷凍股骨頭表面，冷凍位置更加精確；再使用溫生理鹽水對其進行復溫，可以很好地損傷股骨頭，有效縮短股骨頭壞死的疾病進程，同時，縮短造模手術時長，節省了實驗周期。此造模方法雖不能模擬創傷性股骨頭壞死疾病的發病進程，無法進行創傷性股骨頭壞死病因學的研究，但對于后續臨床治療性研究以及對比不同治療方式療效，可以起到很大的作用。

術后4周X線片顯示，患側股骨頭表面光整，可見股骨頭彌漫性骨質疏松，骨小梁稍模糊，出現局限性骨密度增高，骨質硬化，股骨頭周圍可見骨質變薄。拍攝MRI結果顯示：雙側髖關節形態可，右側股骨頭負重區軟骨變薄，可見稍長T1長T2信號，右側髖關節間隙可見少量條片狀液體信號影。組織學顯示：骨小梁稀疏、排列紊亂，骨小梁變細、部分破裂，呈不規則現象，骨陷窩空虛，骨細胞減少，造血細胞減少，骨小梁周圍骨細胞減少；造模術后4周造模側股骨頭骨質輕度破壞，局部周圍組織發生水腫，但MRI檢查未顯示發生壞死。光鏡下觀察組織學特點，可見骨小梁變細、部分破裂，說明經過液氮處理的股骨頭局部骨組織被破壞，但并未出現壞死。

術后8周X線片可見，患側間隙未見明顯變窄，股骨頭輕度變形，股骨頭形態尚可，股骨頭密度不均勻，可見囊性破壞，股骨頸增寬，髖臼邊緣增生。拍攝MRI結果顯示：右側股骨頭負重區可見表面軟骨脫落，可見稍長T1長T2信號。組織學顯示：骨小梁間隙變大，骨小梁破壞嚴重，壞死區空骨陷窩明顯增多，骨小梁間骨髓組織脂肪細胞增多，可見部分壞死骨細胞，骨細胞核固縮、碎裂，骨小梁周圍成骨細胞稀少甚至消失。股骨頭壞死包括了骨頭內部的病理改變，這些改變在MRI信號出現前就已存在，目前，MRI檢查在臨床早期發現診斷股骨頭壞死中較敏感[14]。本實驗X線攝片及MRI檢查可發現造模側關節出現股骨頭壞死早期表現，如軟骨脫落、股骨頭形態變化、局部骨組織密度變化不均等。組織學觀察則更為直觀，造模術后第8周組織學的表現符合股骨頭壞死診斷。通過影像學和組織學觀察后發現此方法對于創傷性股骨頭壞死動物模型制備較為合適。

在選擇合適的動物模型及造模方式時，所選擇的動物應易于喂養，造模方法應難度較低，整體可重復性好。已有選擇鴯鹋作為實驗造模動物[15]，該雙足動物在下肢負重、負重質量上和人類有更高的相似度，相對來說可以更好地模擬人類雙足活動的特點，但因其價格昂貴、飼養困難，且對較大體積的動物進行造模操作時難度較大，故不作為實驗造模動物的首選。兔為四足動物，其繁殖力強、易于獲得、飼養簡單，較實驗動物犬等價格低廉[4，16]，且臨床早中期股骨頭壞死患者診斷明確之后需減少負重，兔為四足動物，后肢負重較少，也利于研究股骨頭壞死的后續治療方法及療效[17]，是目前研究的較好選擇。但此動物模型制備方法在模擬股骨頭壞死疾病發生發展方面還存在不足，家兔與人的股骨近端形態學、血管分布等都有一定的差異，兔股骨頭更小、股骨頸更短，頸干角較人類小，且兔股骨頭頸結合部骨小梁分布相對疏松，以及股骨頸干交界處無骨小梁分布，更有利于滋養動脈穿過從而到達股骨頭，更有利于股骨頭缺血性壞死的修復等，這些與人類有較大差異。目前，我們尚未尋找到完美的模型動物，這也就需要在以后的研究中尋找更為合適、更為接近人類解剖結構的動物模型進行研究[18]。

綜上所述，本研究通過使用液氮冷凍法聯合髖關節脫位法制備兔股骨頭壞死模型，操作簡單，造價低廉，可重復性好，動物死亡率低，對于后續臨床治療性研究以及對比不同治療方式治療創傷性股骨頭壞死療效可以起到支撐作用。但本實驗中尚存在一定的不足：①未設置對照組，只研究了單種造模方法，未直接與其他造模方法進行直觀比較；②模型評價未使用CT、骨掃描等技術進一步豐富實驗資料；③模型適用于早中期股骨頭壞死治療的研究，可以相應縮短總體研究時長，但未能增加時間序列，觀察股骨頭壞死的早期修復過程。以上均有待下一步研究完善。