陽和湯對Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應及腫瘤免疫微環境影響的實驗研究

吳 琳 張渭波 行艷麗 李 艷 趙美峰 姚 歡

1.陜西省咸陽市中心醫院藥學部，陜西咸陽 712000；2.陜西省咸陽市中心醫院病理科，陜西咸陽 712000

陽和湯出自清代王維德的《外科證治全生集》[1]，由麻黃、肉桂、鹿角膠、熟地、炮姜炭、白芥子、生甘草組成，具有溫陽散寒、活血通絡、化痰散結的功效，是治療陰疽的經典效方。陰疽病變部位往往堅硬如石且漫腫不紅，多為陰痰郁滯氣血、阻隔經絡所致，相當于現代醫學的腫瘤[2-3]。近年來，陽和湯廣泛應用于腫瘤的臨床治療[4-5]，相關研究[6-7]顯示，其在腫瘤治療領域具有較好的應用前景。有研究顯示，陽和湯治療腫瘤的具體病種中，肺癌的使用頻率位居第二，僅次于乳腺癌，占比為28.6%[8]。隨著研究的深入，腫瘤免疫微環境已被視為腫瘤的“第七大標記性特征”，在腫瘤形成及進展中發揮著非常重要的作用[9-10]。近年來，中醫藥在調節腫瘤免疫微環境方面具有重要的作用[11-12]，因此本研究擬觀察陽和湯對Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應，對腫瘤免疫微環境中白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、轉化生長因子-β（transformed growth factor-β，TGF-β）的表達及對細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）、調節性T 細胞（regulatory cell，Treg）的影響，以期為陽和湯治療肺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

一月齡SPF 級C57BL/6 小鼠50 只，雄性，體重18～22 g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心，許可證號SCXK（陜）2018-001，合格證號410021003105 279。飼養在陜西中醫藥大學實驗中心動物房（溫度22～27℃，相對濕度45%～66%），小鼠可自由飲水并攝取食物。動物實驗經陜西中醫藥大學科研倫理委員會批準。小鼠Lewis 肺癌細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實驗藥物

陽和湯由熟地30 g、鹿角膠9 g、白芥子6 g、肉桂3 g、生甘草3 g、麻黃2 g、炮姜炭2 g 組成，藥材均購于西安中藥飲片有限責任公司，經陜西中醫藥大學藥學院中藥鑒定學教研室鑒定，按上述劑量稱取，根據常規方法煎煮（鹿角膠打粉烊化），濃縮至2.75、1.84、0.92 g/ml 的藥液，置于4℃冰箱備用。環磷酰胺片（50 mg/片）購于通化茂祥制藥有限公司（201902）。

1.3 主要試劑

Rabbit anti-mouse IL-2（江蘇親科生物研究中心有限公司，AF5105）；Rabbit anti-mouse TGF-β（博士德生物工程有限公司，BA0290）；Rabbit anti-mouse CD3（江蘇親科生物研究中心有限公司，DF6594）；Rabbit anti-mouse CD25（江蘇親科生物研究中心有限公司，DF7132）；Rabbit anti-mouse CD4（北京博奧森生物技術有限公司，BF0174）；Rabbit anti-mouse CD8（北京博奧森生物技術有限公司，EC6872）；Rabbit anti-mouse FoxP3（北京博奧森生物技術有限公司，AF6544）；Rabbit IgG-SABC-FITC kit（江蘇親科生物研究中心有限公司，S0011）；DAPI 染色液（博士德生物工程有限公司，AR1176）。

1.4 儀器設備

CO2培養箱（美國Thermoe scientifican 公司，CCB-150 型）；離心機（德國Eppendorph 公司，Centrifuge 5427R）；電子精密天平（德國Sartorius 公司，bsa423s，精度0.01 g）；石蠟切片機（德國Leica 公司，RM2235）；生物組織自動脫水機（湖北泰維科技實業有限公司，TC-120S）；自動恒溫烘片儀（湖北泰維科技實業有限公司，TK-213）。

1.5 實驗方法

將培養濃度為2×107/ml Lewis 肺癌細胞懸液0.2 ml分別接種在適應性喂養5 d 后的50 只雄性C57BL/6小鼠右側前腋皮下以形成Lewis 肺癌荷瘤模型。按照隨機數字表法將其分為荷瘤模型組、環磷酰胺組、陽和湯高劑量組、陽和湯中劑量組和陽和湯低劑量組，每組10 只。造模5 d 后用手觸摸到接種部位有結節提示造模成功，分別用生理鹽水、環磷酰胺（25 mg/kg）、陽和湯高劑量（27.5 g/kg）、陽和湯中劑量（18.3 g/kg）、陽和湯低劑量（9.2 g/kg）進行灌胃給藥，0.2 ml/次，1 次/d，連續10 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 小鼠的體重、瘤重及抑瘤率 首次給藥前及末次給藥后的第2 天分別稱量各組小鼠的體重；末次給藥后的第2 天脫頸處死小鼠剝離右側前腋下的瘤塊并稱取重量，并計算抑瘤率。抑瘤率=（荷瘤模型組平均腫瘤重量-實驗組平均腫瘤重量）/荷瘤模型組平均腫瘤重量×100%。

1.6.2 Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 的表達 對剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫組化法檢測IL-2和TGF-β 的表達，具體操作嚴格參照試劑盒說明書步驟進行。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件測量IOD/Area，并進一步對腫瘤組織中表達的IL-2、TGF-β 進行定位、定性及相對定量分析。

1.6.3 Lewis 肺癌組織中CTL 和Treg 的標志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達情況 對剝離并稱重后的腫瘤組織采用免疫熒光技術檢測CTL 和Treg 的標志物CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達，具體操作嚴格參照試劑盒說明書步驟進行。結果判讀方法：在紫外光的激發下DAPI 染出的細胞核為藍色，相對熒光素標記的紅色光為其陽性表達，通過Image J 軟件做最后處理。

1.7 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體重、瘤重及抑瘤率比較

用藥前，各組小鼠體重比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。用藥后，與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組小鼠體重降低（P <0.01），陽和湯高、中劑量組小鼠體重增加（P <0.05 或P <0.01）；與環磷酰胺組比較，陽和湯高、中、低劑量組小鼠體重增加（P <0.01）；與陽和湯高劑量組比較，陽和湯低劑量組小鼠體重降低（P <0.05）。與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組、陽和湯高劑量組小鼠瘤重降低（P <0.05 或P <0.01）；與環磷酰胺組比較，陽和湯中、低劑量組小鼠瘤重增加（P <0.05）；陽和湯高劑量組小鼠瘤重與環磷酰胺組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。抑瘤率由高到底分別為環磷酰胺組、陽和湯高劑量組、陽和湯中劑量組、陽和湯低劑量組。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重及抑瘤率比較

2.2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達比較

IL-2 和TGF-β 的表達位于細胞間質，呈黃色或棕黃色，見圖1～2。與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達降低（P <0.01），陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達增加（P <0.05 或P <0.01）；與環磷酰胺組比較，陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達增加（P <0.01）；與陽和湯高劑量組比較，陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織IL-2 表達降低（P <0.01）。與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組，陽和湯高、中劑量組小鼠Lewis 肺癌組織TGF-β 表達降低（P <0.01）；與環磷酰胺組比較，陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis肺癌組織TGF-β 表達增加（P <0.05）。見表2。

圖1 小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2 免疫組織化學法染色結果

圖2 小鼠Lewis 肺癌組織中TGF-β 免疫組織化學法染色結果

圖3 小鼠Lewis肺癌組織中CD3+CD8+免疫熒光結果

表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達比較（）

表2 各組小鼠Lewis 肺癌組織中IL-2、TGF-β 表達比較（）

注：與荷瘤模型組比較，aP ＜0.05、bP ＜0.01；與環磷酰胺組比較，cP ＜0.05、dP ＜0.01；與陽和湯高劑量組比較，eP ＜0.01。IL-2：白細胞介素-2；TGF-β：轉化生長因子-β

2.3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達比較

免疫熒光檢測中，陽和湯高劑量組CD3+CD8+的熒光強度強、密度最大；環磷酰胺組CD4+Foxp3+密度最小，其次是陽和湯高劑量組。見圖3～4（封四）。與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達降低（P <0.01），陽和湯高、中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達增加（P<0.05 或P <0.01）；與環磷酰胺組比較，陽和湯高、中、低劑量組小 鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達增加（P <0.01）。與陽和湯高劑量組比較，陽和湯中、低劑量組小鼠Lewis 肺癌組織CD3+CD8+表達降低（P <0.01）。與荷瘤模型組比較，環磷酰胺組，陽和湯高、中劑量組小鼠Lewis肺癌組織CD4+Foxp3+表達降低（P <0.05 或P<0.01）。見表3。

表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達比較（）

表3 各組小鼠Lewis 肺癌組織中CD3+CD8+與CD4+Foxp3+表達比較（）

注：與荷瘤模型組比較，aP ＜0.05、bP ＜0.01；與環磷酰胺組比較，cP ＜0.01；與陽和湯高劑量組比較，dP ＜0.01

3 討論

Stephen Paget 在1889 年提出的“種子與土壤”假說，為腫瘤微環境概念的提出奠定了基礎[13]。腫瘤微環境是腫瘤細胞形成和增殖過程中所依賴的生長環境，是腫瘤發生和轉移的關鍵因素[14-15]，是機體的免疫系統發揮抗腫瘤免疫應答的主要場所，是抗腫瘤免疫的重要部分[16-17]。其中由免疫相關細胞和因子及其他活性成分構成的“腫瘤免疫微環境”影響著腫瘤的發生與發展[18-19]。在腫瘤免疫微環境中，CTL 在抗腫瘤免疫應答中對腫瘤細胞具有高度特異性和殺傷效應，與自然殺傷（natural killer，NK）細胞共同發揮抗腫瘤作用[20]，該細胞主要標志物為CD3+CD8+。IL-2 又稱T 細胞生長因子，能促進CTL 和NK 細胞活化和增殖[21-22]，介導抗腫瘤的細胞毒效應。Treg 是一類具有免疫抑制功能的CD4+T 細胞功能亞群，其中表達CD4+Foxp3+的Treg 通過產生TGF-β 等細胞因子對腫瘤免疫微環境發揮免疫抑制作用[23-24]。同時TGF-β 又可誘導Treg 細胞的擴增[25]。

環磷酰胺的細胞毒性免疫抑制雖然有顯著的抑瘤效應，但能降低荷瘤小鼠體重和腫瘤免疫微環境中IL-2、TGF-β 表達及CTL、Treg 的含量。高劑量陽和湯在抑瘤效應方面與環磷酰胺比較，差異無統計學意義（P ＜0.05），且不影響荷瘤小鼠的體重，并能促進腫瘤免疫微環境中發揮抗腫瘤效應的IL-2 表達和CTL 增加，降低腫瘤免疫微環境中具有抑制作用的TGF-β表達及Treg 的含量。陽和湯中、低劑量的抑瘤效應不是很明顯，但在調節腫瘤免疫微環境中IL-2、TGF-β的表達和CTL、Treg 的含量方面發揮著一定的作用，且不影響荷瘤小鼠的體重。本研究結果顯示，陽和湯對荷瘤小鼠的Lewis 肺癌組織具有一定的抑制作用。其抑制腫瘤的機制可能與影響腫瘤免疫微環境中IL-2、TGF-β 表達及CTL、Treg 的含量有關。應進一步開展陽和湯對腫瘤免疫微環境中的免疫相關細胞和因子及其它活性成分的影響研究，以深入探討其抑瘤作用機制。