基于SRAP分子標記的油梨種質資源遺傳多樣性分析

甘霖 高樂 陳麗娜 何鵬

摘要：【目的】基于SRAP分子標記分析油梨種質資源的遺傳多樣性，為油梨種質資源新品種選育及創新利用提供理論依據?！痉椒ā恳?0份油梨種質為材料，從184對SRAP引物組合中篩選出擴增條帶清晰且多態性較好的引物組合，利用其對油梨種質材料進行PCR擴增，基于擴增結果，利用PopGene 1.32計算遺傳多樣性指數;利用NTSYS 2.1的UPGMA（非加權組平均法）計算遺傳相似系數，并進行聚類分析?！窘Y果】從184對SRAP引物組合中篩選出17對擴增條帶清晰且多態性較好的引物，利用該17對引物對50份供試油梨種質材料進行PCR擴增，共擴增出322條條帶，其中多態性條帶有206個，平均每條引物擴增出12.12條，多態比率為63.75%。50份油梨種質材料的觀測等位基因數（Na）為1.0844～1.4034，平均為1.2493;有效等位基因數（Ne）為1.0067～1.6028，平均為1.3390;Neis遺傳多樣性指數（H）為0.0642～0.1466，平均為0.1439;Shannons信息指數（I）為0.0634～0.1759，平均為0.1308。大嶺2號與油梨種質4號的遺傳一致度最高（0.9237），遺傳相似系數最大（0.92），同時二者之間的遺傳距離最?。?.1365），表明大嶺2號與油梨種質4號種質間的親緣關系最近。油梨種質5號與Fuerte間的遺傳一致度相對最?。?.3765），且二者間的遺傳距離最大（0.8253），說明油梨種質5號和Fuerte的親緣關系相對最遠。在遺傳相似系數0.48處，50份油梨種質被分為四大類群，海南白沙油梨種質集中在第Ⅲ類群，海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布，表明海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質的遺傳多樣性均較豐富?！窘Y論】海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質的遺傳多樣性相對較豐富，可為油梨親本選配和育種等方面的創新利用提供材料基礎。

關鍵詞： 油梨;SRAP;遺傳多樣性;群體結構

中圖分類號： S667.902.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1798-08

Genetic diversity analysis of avocado germplasm resources based on SRAP molecular markers

GAN Lin1， GAO Le1， CHEN Li-na2， HE Peng1*

（1Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Danzhou， Hainan? 571737， China;

2Guangzhou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Guangzhou? 510140， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of avocado germplasm resources was analyzed based on SRAP molecular markers，which provided a theoretical basis for the breeding and innovative utilization of new varieties of avocado germplasm resources. 【Method】Using 50 avocado germplasm as materials，184 pairs of SRAP primer combinations with clear amplification bands and good polymorphism were selected. The genetic diversity index of avocado germplasm was calculated by PopGene 1.32 based on the amplification results. The genetic similarity coefficient was calculated by UPGMA （unweighted group average method） of NTSYS 2.1，and cluster analysis was carried out. 【Result】A total of 17 primer pairs with clear amplification and good polymorphism were selected from 184 pairsof SRAP primer combinations. A total of 322 bands were amplified by PCR from 50 tested avocado germplasm materials by the 17 primer pairs，of which 206 were polymorphic，with an average of 12.12 amplified by each primer，and the polymorphism rate was 63.75%. The observed allele number（Na） of 50 avocado germplasm materials was 1.0844-1.4034，with an average of 1.2493，effective number of alleles（Ne） was 1.0067-1.6028，with an average of 1.3390. Neis genetic diversity index（H） was 0.0642-0.1466，with an average of 0.1439，Shannons information index（I） was 0.0634-0.1759，with an average of 0.1308. Daling 2 and avocado germplasm 4 had the highest genetic consistency（0.9237），the highest genetic similarity coefficient（0.92），and the lowest genetic distance（0.1365），indicating that Daling 2 and avocado germplasm 4 had the closest genetic relationship. The genetic consistency between avocado germplasm 5 and Fuerte was the minimum（0.3765），and the genetic distance between them was the largest（0.8253），indicating that the genetic relationship between avocado germplasm 5 and Fuerte was the farthest. At the genetic similarity coefficient of 0.48，50 avocado germplasm were divided into four groups. Avocado germplasm from Baisha，Hainan was concentrated in group III，and avocado germplasm from Danzhou， Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi were distributed in groups I，II and IV，indicating that avocado germplasm from? Danzhou，Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi were rich in genetic diversity. 【Conclusion】The genetic diversity of avocado germplasms from Danzhou，Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi are more abundant than that from Baisha，which provided a theoretical basis for innovation in parents selection and breeding.

Key words： avocado; SRAP; genetic diversity; population structure

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN324）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630022018013）

0 引言

【研究意義】油梨（Persea americana Mill.）別名鱷梨、牛油果，屬樟科油梨屬常綠喬木果樹，原產于拉丁美洲，其營養豐富，富含脂肪酸（8%～30%）、碳水化合物（2%～9%）、蛋白質（1%～3%）及多種維生素，香甜可口，既是水果又是糧食，具有“世界名貴果品”之稱，在世界范圍內的40多個國家和地區均有栽培，其種植面積高達50萬ha，年產量為350萬～400萬t（應東山等，2018;Rosero et al.，2019;Tugiyanti et al.，2019）。我國于20世紀20年代初開始引種試種油梨，目前在海南、廣東、廣西和云南等地均有種植，其種植面積高達1.5萬ha（李家興，2010;何國祥，2012;張良等，2015）。近年來，我國對農業種質資源的收集、保存和利用工作十分重視，越來越多的科研單位和企業從國外引入油梨新品種，但對其品種間的親緣關系、種群結構等信息尚不清楚，嚴重影響油梨種質的創新利用及其育種研究的深入發展。因此，研究分析油梨種質的遺傳多樣性對其種質資源保存、創新利用及新品種選育均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】SRAP分子標記技術已廣泛應用于作物種質的遺傳多樣性分析、種群結構分析、種質資源鑒定等研究領域，其中包括蘋果（張春雨等，2009）、荔枝（趙玉輝等，2010）、梨（梁婷婷等，2015）、柚（林紹生等，2015）、芒果（羅世杏等，2018;劉榮等，2019）等果樹。目前，我國對油梨遺傳多樣性的研究報道較少。李家興（2010）根據生物學特性分析了貴州地區油梨種質的群體結構。周海蘭（2016）利用12條多態性ISSR引物對112份油梨材料進行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數為0.72時，供試材料分為七大類群。周海蘭等（2016）建立了穩定的SSR-PCR反應體系及篩選出穩定的油梨SSR多態性引物。應東山等（2018）利用轉錄測序技術開發了34對多態性SSR引物，為油梨種群的遺傳多樣性分析及親本鑒定提供新途徑。周兆禧等（2019）以國內收集的170份油梨種質資源為材料，對其15個表型性狀進行遺傳多樣性分析，結果表明油梨種質資源的遺傳變異類型較豐富。郭俊等（2020）以32份油梨種質資源為材料，開發了40對多態性SSR引物，并將其分為四大類?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見利用SRAP分子標記進行油梨種質遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】開發多態性SRAP分子標記，分析不同油梨種質的遺傳多樣性和遺傳結構，為油梨種質資源的創新利用和新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的50份油梨種質分別來自中國熱帶農業科學院橡膠研究所五隊試驗基地（海南儋州）、南亞熱帶作物研究所國家熱帶果樹種質資源圃（廣東湛江）、廣西職業技術學院果樹基地（廣西南寧）及海南省白沙市大嶺農場（海南白沙）（表1）。主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、DNA提取所需試劑、瓊脂糖、丙烯酰胺、DL2000 DNA Marker等均購于上海生工生物工程技術服務有限公司，SRAP引物由深圳華大基因科技服務有限公司合成。主要儀器：低溫高速離心機（Eppendorf centrifuge 5804R，德國）、梯度核酸擴增儀（TP1600，澳大利亞）、垂直電泳系統（北京六一儀器廠）和核酸凝膠成像系統（G-BOXF3）。

1. 2 樣品采集和DNA提取

采集油梨嫩葉1～2片/株，采用CTAB法提取葉片DNA（周麗霞等，2013），于-20 ℃保存備用。

1. 3 引物篩選

隨機選取大嶺2號的DNA為模板，對184對SRAP引物組合進行篩選。反應總體系15.0 μL：DNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master-Mix（含染料）8.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補足至15.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，進行5個循環，將退火溫度升至56.4 ℃，進行30個循環;72 ℃延伸7 min。

1. 4 統計分析

用Excel 2010統計PCR產物中清晰可辨的條帶數，相同位置有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，從而構建成原始數據矩陣。利用NTSYS 2.1的UPGMA（非加權組平均法）計算遺傳相似系數，并繪制聚類圖;利用PopGene 1.32計算遺傳多樣性指數。

2 結果與分析

2. 1 SRAP引物篩選結果

以大嶺2號DNA為模板，利用184對SRAP引物組合進行PCR擴增，根據PCR產物條帶的清晰度、穩定性及多態性的豐富度，共篩選出17對SRAP引物，引物序列如表2所示。利用該17對引物對50份供試油梨種質材料進行PCR擴增，共擴增出322條條帶，其中多態性條帶有206條，平均每條引物擴增出12.12條，多態比率為63.75%（表2）。圖1為引物組合Me7/Em18對50份供試油梨種質的擴增圖譜，同一引物針對不同的供試油梨種質材料，其擴增結果差異較大，說明該供試群體的遺傳多樣性較豐富?？梢?，SRAP分子標記可用于油梨種質的遺傳多樣性分析。

2. 2 油梨種質資源的遺傳多樣性分析結果

應用PopGene 1.32計算50份油梨種質的遺傳多樣性指數，結果如表3所示。50份油梨種質的觀測等位基因數（Na）為1.0844～1.4034，平均為1.2493;有效等位基因數（Ne）為1.0067～1.6028，平均為1.3390;Neis遺傳多樣性指數（H）為0.0642～0.1466，平均為0.1439;Shannons信息指數（I）為0.0634～0.1759，平均為0.1308，說明50份油梨種質材料的遺傳多樣性較豐富。

50份油梨種質材料的遺傳一致度和遺傳距離如表4所示。廣東湛江與海南儋州的遺傳一致度相對最高，為0.9237，同時二者之間的遺傳距離最小，為0.1365，說明這兩個地區油梨種質的親緣關系最近。廣西南寧與廣東湛江油梨種質的遺傳一致度相對最小，為0.4308，且二者的遺傳距離最大，為0.6730，說明這兩個地區間油梨種質的親緣關系相對最遠。

應用NYSTS 2.1計算油梨遺傳相似系數，結果（表5）顯示50份供試油梨材料的遺傳相似系數為0.22～0.92，其中大嶺2號（編號1）與油梨種質4號（編號2）的遺傳相似系數最大，為0.92，說明二者親緣關系最近;油梨種質4號（編號2）與Fuerte（編號5）的遺傳相似系數最小，為0.22，說明二者親緣關系最遠。

2. 3 油梨種質資源的聚類分析結果

為了分析50份供試油梨種質的群體結構，應用UPGMA對其進行聚類分析，結果見圖3。在遺傳相似系數為0.48時，50份供試油梨種質被分為四個大類群，其中來自海南白沙市的油梨種質集中分布在第Ⅲ類群，其他3個地區的油梨種質在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布。第Ⅰ類群含有20份油梨種質：大嶺2號、油梨種質5號、Hass、RN-1、RN-4、RN-5、Beta、Tonnie、Simmonds、Migule、Monroe、Wilson seedless、NR-3、RLW-3、RLW-4、RLW-10、GY-5、GY-7、GY-15和GY-16;第Ⅱ類群含有15份油梨種質：Fuerte、RN-11、RN-17、RN-18、Dupuis、Tonnage、Brooks late、Loretta、Peterson、NR-5、RLW-2、RLW-6、GY-2、GY-3和GY-11;第Ⅳ類群含有5份油梨種質：油梨種質4號、Lula、NR-10、RLW-1和GY-12。表明海南省白沙市油梨種質的遺傳多樣性相對單一，遺傳背景相對狹窄，群體內親緣關系較接近;海南儋州、廣東湛江和廣西南寧的油梨種質在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布，說明其遺傳多樣性豐富度高，親緣關系較遠，群體結構較復雜?？傮w來看，50份供試油梨種質的遺傳多樣性較豐富。

3 討論

3. 1 SRAP分子標記是分析油梨遺傳多樣性的有效手段

SRAP分子標記已廣泛用于多種植物種質資源的遺傳多樣性分析（王國澤等，2013），但鮮見應用于油梨的相關研究報道。本研究應用SRAP分子標記對50份油梨種質材料進行遺傳多樣性分析，共篩選出17對多態性較好的引物組合，獲得322個清晰的位點，其中多態性位點有206個，其多態比率為63.75%。該結果高于孟慧等（2018）對海南降香檀（52.8%）、高寧寧等（2019）對甜瓜（58.0%）的SRAP多態比率，低于洪建聰等（2019）對野生白及（90.6%）的SRAP多態比率，說明SRAP分子標記是一種可用于油梨遺傳多樣性分析的有效手段。

3. 2 基于SRAP分子標記的油梨種質資源遺傳特點

觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Neis多樣性指數（H）和Shannons信息指數（I）是判斷物種間種質資源遺傳多樣性豐富度的常用指標，可明確當前收集的油梨遺傳變異動向，了解其遺傳多樣性，為育種工作提供理論基礎。本研究中，供試50份油梨種質的Na為1.7225，Ne為1.8818，H為0.1977及I為0.1308，與紅米（馬孟莉等，2019）、鐵皮石斛（楊貞等，2019）的研究結果相似，表明供試油梨種質的遺傳多樣性較豐富。其中，來自廣東湛江的油梨種質遺傳多樣性指數（Na、Ne、H和I）最高，其次為廣西南寧，海南白沙的油梨種質遺傳多樣性指數最低，結果表明廣東湛江和廣西南寧的油梨種質遺傳多樣性較豐富，海南儋州油梨種質的遺傳背景相對豐富，海南白沙油梨種質的遺傳背景最簡單，親緣關系最近。

本研究應用UPGMA對50份油梨種質材料進行聚類分析，結果將其分為四大類群，其中海南白沙的油梨種質主要集中分布在第Ⅲ類群，而其他3個地區的種質分布較為分散，說明海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質遺傳多樣性較高，海南白沙油梨種質的遺傳多樣性相對最低，與上述計算所得的遺傳多樣性指數結果相符。不同種源遺傳多樣性參數差異明顯，遺傳多樣性的變化原因較復雜，其本質原因是物種等位基因數目或頻率的變化，同時受遺傳漂變、自然選擇等因素影響，還包括人為干擾、環境變化及地理隔離等。我國從20世紀20年代開始引種油梨，目前廣泛種植在廣東、廣西、福建及海南等?。▍^），其中廣東和廣西已建成我國重要的油梨生產基地，涵蓋了從墨西哥和印度尼西亞等國家引入的多個優良油梨種質，1960年儋州華安熱帶作物學院在其試驗站內開始建油梨種植園，先后分別從美國和澳大利亞引入多種適合海南西部地區種植的油梨品種。因此，廣東、廣西和海南儋州涵蓋的的油梨種質遺傳背景相對豐富，基因流影響較大，遺傳相似性較低，遺傳多樣性水平也較高。海南白沙大嶺農場現主要是以家庭分散的經營模式為主，農場油梨園為輔，粗放式管理，品種未更新，遺傳相似性較高，遺傳多樣性相對較低?？梢?，SRAP分子標記可有效地判斷油梨種質親緣關系的遠近，同時可用于鑒定評價物種種質資源群體結構的有效方法。

優良且多樣的種質資源可為新品種培育提供基礎材料，只有掌握種質資源的種群結構、遺傳背景及遺傳信息，才能對其進行充分有效的創新利用。本研究應用SRAP分子標記對50份油梨種質材料進行遺傳多樣性分析，結果發現海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質的遺傳多樣性較豐富，遺傳背景較復雜。在此基礎上，今后應進一步調查研究海南儋州、廣東湛江及廣西南寧地區油梨的表型性狀，并與遺傳性狀進行關聯分析，為親本選配及油梨新品種培育提供材料基礎。

4 結論

海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質的遺傳多樣性較豐富，可用作油梨親本選配育種及創新利用的基礎材料。

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（責任編輯 陳 燕）