一株產果香型真菌的篩選、鑒定及在煙草增香中的應用

張鵬，李煒，師超，高加明，任杰，申國明，張忠鋒

摘? 要：煙葉香氣不足一直制約著煙葉品質及其工業可用性。為開發新的煙草香料，本研究從湖北省利川市煙草種植區的煙葉中篩選到產果香型菌株R59，經鑒定為產黑色素短梗霉Aureobasidium melanogenum。發酵后，該菌株能夠產生11種香氣化學物質，其中果香型的苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯的濃度均超過100 μg/mL。對發酵培養基進行優化，發現以30 g/L的葡萄糖作為碳源，15 g/L玉米漿作為氮源，培養基pH為5.0條件下培養R59菌株，可有效提高菌株中苯乙醛和醋酸異戊酯的產量。噴灑10 μL/g R59菌株發酵液可有效改善煙絲的協調性、香氣和余味。R59菌株產香發酵成本低，添加工藝簡單，可以作為一種提高煙草品質的香料來源。

關鍵詞：果香型真菌;煙草;增香;感官評價

Screening and Identification of a Fungus with a Sweet Fruit Aroma and Its Application in Flavoured Tobacco

ZHANG Peng1， LI Wei2， SHI Chao3， GAO Jiaming4， REN Jie1， SHEN Guoming1， ZHANG Zhongfeng1*

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Shanghai Tobacco Group Beijing Cigarette Factory Co.， Ltd. Beijing 101121， China; 3. Lichuan Branch of Enshi Tobacco Company， Lichuan， Hubei 445400， China; 4. Hubei Provincial Tobacco Company of China National Tobacco Corporation， Wuhan 430000， China）

Abstract： Insufficient aroma of tobacco leaves has always been a major factor limiting the quality of tobacco leaves and their industrial availability. In order to develop a new source of spices， the R59 strain with a sweet fruit aroma was isolated from healthy leaves of tobacco collected from Lichuan， Hubei province. This strain was identified as Aureobasidium melanogenum. In this study， eleven aroma components were detected in the fermentation broth. Among them， phenylethyl alcohol， phenylacetaldehyde， and isoamyl acetate， which possessed fruity arama， were produced more than 100 μg/mL. After fermentation medium optimization， the production of phenylacetaldehyde and isoamyl acetate by the R59 strain was increased significantly when cultured in 30 g/L glucose， 15 g/L corn steep liquor at pH 5.0. Spraying of the fermentation broth onto cut tobacco at a dosage of 10 μL/g could effectively improve its coordination， aroma and aftertaste. Due to its low fermentation cost and simple addition process， the R59 strain can be used as an aroma source to significantly improve the quality of cigarette products.

Keywords： fruity fungi; tobacco; fragrances enhancement; sensory evaluation

煙草是我國重要的經濟作物之一。卷煙的香氣品質直接影響消費者的吸食口感，是評價卷煙產品的重要指標。提高卷煙的香氣品質有多種方法，如選育高香品質的煙草品種[1]、改善煙草的栽培模式[2]及在卷煙加工過程中添加香料[3]等。其中外源添加香料在卷煙加工中最為常用，可以直接、有效地提升卷煙的香氣品質，掩蓋煙葉的刺激性和雜氣。但是，外源添加香料目前主要以化學合成為主，合成過程中產生的廢棄物和潛在有害物質會造成環境污染。因此，研發綠色、環保的新型香料，替代化學合成的卷煙香料，對于煙草香料行業的健康發展至關重要。

自然界中有多種微生物能夠產生香氣物質，為新型天然源香料的開發提供了途徑[4]。微生物產香種類豐富，細菌類的枯草芽孢桿菌能夠產生乙醇、乙酸乙酯等，呈現醇香、果香和甜香等特征性香氣;地衣芽孢桿菌能產生草酸、甲酸乙酯、丙酮醛等，呈現辛香、蜂蜜香、醋酸香和醬香等特征性香氣[5];真菌類如東方伊薩酵母能夠合成特殊的酯類物質，產生蟠桃香;畢赤酵母高產乙酸乙酯，可增加果香[6];釀酒酵母和畢赤酵母混合發酵產生花香果香，尤其是熱帶水果型香氣;馬克斯克魯維酵母能產生高達400 mg/L的苯乙醇[7]，該物質具有典型的玫瑰香氣，常作為煙草香料的重要組分[8-9]。

微生物發酵產香具有生產周期短、對環境友好等特點，已在白酒[10]、食醋[11]、醬油、腐乳、豆豉等加工行業中得到應用。國內對煙葉產香微生物的研究起步較晚，目前尚未建立起適合發酵生產卷煙香料的微生物群落結構體系。本研究從煙草植株上篩選產香的微生物，并對關鍵致香成分和發酵條件進行鑒定和優化，評價其發酵產物在煙草增香中的應用效果，旨在發掘適用于卷煙增香的微生物，豐富煙草行業新型香料的來源，開發具有良好風味的新型煙草制品。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

供試煙葉于2018年7月采自湖北省恩施土家族苗族自治州利川市煙草種植區，分別于不同海拔（800、1000和1200 m）產區采集煙草上部、中部和下部烤后葉。

1.2? 試劑和培養基

1.2.1? 試劑? 試驗PCR用高保真Phanta酶和DNA提取試劑盒購自于南京諾唯贊生物科技有限公司，擴增DNA片段所用引物和ITS rDNA序列由青島擎科生物科技有限公司合成，DNA Marker購自于北京全式金生物技術有限公司，培養基配置所需葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉和瓊脂等均購自于國藥集團化學試劑有限公司，豆餅粉、玉米漿及玉米蛋白粉購自于青島科瑞培養基有限公司;色譜純化學試劑甲醇、二氯甲烷、苯乙醛、乙酸苯乙酯、醋酸異戊酯均購自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.2? 培養基? 牛肉膏蛋白胨培養基：0.5%（m/v，下同）牛肉膏，1%蛋白胨，1%氯化鈉。LB液體培養基：1% NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉;固體培養基配置時加入1.5%瓊脂。YPD液體培養基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉;固體培養基配置時加入1.5%瓊脂。

所有培養基均于115 ℃滅菌30 min后使用，其中LB培養基用于培養細菌，YPD培養基用于培養酵母菌和絲狀真菌。

1.3? 煙草微生物的分離

稱取10 g煙葉樣品，剪碎加入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，放于28 ℃搖床中振蕩培養48 h，轉速為150 r/min。用血球計數板對培養基中的微生物進行計數，后用無菌水稀釋至每微升培養基中微生物個數為1～10。將稀釋后的培養液在LB平板上涂布以分離細菌，在YPD平板上進行涂布以分離真菌（包括酵母菌），分別于28 ℃和37 ℃靜置培養48 h。挑取菌落形態不同的微生物在固體培養基上劃線純化后，置于30%的甘油中于–80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.4? 產果香微生物的篩選

將篩選到的微生物菌株于搖床中振蕩培養48 h后，進行感官質量評價[12]。產香品質的評價指標包括4個方面：香氣度、差異度、留香時間、刺激性。差異度由小到大滿分10分，香氣由弱到強滿分20分，留香時間由短暫到持久滿分10分，刺激性由大到小滿分10分。分數越高，香味品質越好，篩選最佳的產果香微生物。

1.5? 果香菌株的鑒定

選取產香賦分值最高的菌株，將其在YPD平板上劃線，28 ℃靜置培養48 h后，觀察其菌落形態和細胞形態[9-11]。設計合成真菌通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，擴增菌株的ITS rDNA序列后送青島擎科生物科技有限公司測序。測序結果在NCBI上進行Blast比對，在Blast結果的基礎上，查找與此菌株進化關系相近的標準菌株的ITS rDNA?；卩徫幌嘟臃?，構建系統發育樹進行種屬鑒定。

1.6? 發酵液中香氣成分的分析

將產香賦分值最高的菌株接于YPD液體培養基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養48 h。將發酵液離心，取上清液，等體積加入二氯甲烷并混勻。將發酵液萃取有機相減壓蒸餾至徹底干燥，然后加入適量二氯甲烷，用于氣質聯用（GC/MS）分析，氣相色譜條件參照文獻[9-10]。質譜條件中接口溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;離子化方式EI;電子能量70 eV;質量掃描范圍（m/z）35～400。得到的質譜結果與數據庫中的已有物質比較，確定化合物種類，再根據峰面積計算各成分的含量和濃度。

1.7? 苯乙醛和醋酸異戊酯含量的測定

苯乙醛和醋酸異戊酯含量用HPLC方法測定[13]，色譜柱為Waters 2695和Platisil C18柱（4.6 mm×250 mm）;紫外檢測器，檢測波長為210 nm;流動相為甲醇-水，梯度洗脫，流速為1 mL/min。根據峰面積，按照標準品標準曲線進行苯乙醛和醋酸異戊酯含量測定。

標準品標準曲線的制定：將色譜純苯乙醛和醋酸異戊酯分別配制成濃度為10～150 mg/L的工作溶液，使用0.45 μm有機過濾膜過濾，進行HPLC分析，根據峰面積制作標準曲線，得到標準曲線方程。

1.8? 發酵產香條件的優化

發酵培養基的優化主要考慮葡萄糖濃度、氮源種類、玉米漿濃度和pH等4個因素對菌株產香的影響，葡萄糖濃度設置為：15、20、25、30、35、40 g/L;氮源選擇為蛋白胨和酵母粉、玉米漿、玉米蛋白、（NH4）2SO4、豆餅粉5組;玉米漿濃度設置為10、15、20、25、30、35 g/L;pH設置為4.5、5、5.5、6、6.5、7。先將選取的菌株接種于YPD液體培養基中，放于30 ℃搖床150 r/min振蕩培養24 h，得到種子培養液。取5 mL種子培養液接入不同發酵培養基，30 ℃繼續振蕩培養36 h后，測定發酵液中苯乙醛和醋酸異戊酯含量。

1.9? 發酵液增香效果的感官評價

在1.8所述條件下培養產香賦分值最高的菌株，將發酵液用0.45 μm濾膜過濾除菌后均勻噴灑于煙絲表面，噴灑量為5～20 μL/g，后將煙絲放置于25 ℃、65%的濕度環境下平衡6 h，制成煙支。以不噴灑菌株發酵液的煙絲為對照。感官質量由中國農業科學院煙草研究所和頤中（青島）實業有限公司技術中心評吸專家進行綜合評價[14-15]。

2? 結? 果

2.1? 產果香微生物的篩選

從不同海拔、不同部位煙葉中共分離得到細菌69株和真菌57株，作為增香微生物篩選的菌種庫。純化過的菌株在平板劃線過程中，通過初步的嗅覺篩選，發現有5株微生物能產生較為明顯的果香。5個菌株繼續在28 ℃和160 r/min下振蕩培養36 h，采用嗅香的方式進行感官評價并賦分比較。如表1所示，A1、R59、A13和B2 四株菌產香均較強，差異度也比較明顯，其中R59的產香能力最強;綜合停留時間和刺激性，R59菌株得分最高。R59菌株能夠產生清甜水果香氣，夾雜著一種特殊的玫瑰香味，且香氣持久，雜氣較輕，故將其用于后續的產香和應用研究。

2.2? 菌株鑒定

不同種類的微生物具有不同的菌落和細胞形態，是區分不同微生物的重要標準。在YPD培養基上生長3 d后，R59菌株的菌落較濕潤且不光滑，呈淡黃色到淡粉色，菌落外周有放射狀突起（圖1A）。在油鏡下觀察，該菌株的細胞體積較釀酒酵母細胞大，多數為橢圓形，部分細胞能觀察到正在進行出芽生殖，也有一部分細胞連在一起形成假菌絲（圖1B）。綜上所述，R59菌株的菌落形態和細胞形態與短梗霉類似。

rDNA序列在真菌基因組合中成簇存在，具有較高保守性，常用于菌株的分子鑒定。在rDNA各個區域中，ITS rDNA與26S rDNA和18S rDNA區域相比具有更高的變異度，同時其保守性也足以用于進行酵母的種屬區分。如圖2所示，R59菌株與短梗霉屬的CBS109800菌株位于進化樹的同一支，說明其進化關系最為接近，兩者的ITS rDNA相似度超過99%。綜合形態學觀察和分子生物學鑒定結果，R59菌株的種屬位置鑒定為Aureobasidium melanogenum。

2.3? 香氣物質成分分析

利用液質聯用對R59菌株發酵液中的香氣成分進行了分析[16-17]，檢出了11種香氣成分，包括多種酯類物質（表2）。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯3種香氣成分占比最高，濃度分別為172.9、261.2和127.3 μg/mL，說明它們對R59菌株發酵液中的香氣貢獻較大。此外，也檢測出3-甲基丁醛、乙酸乙酯、苯甲酸苯乙酯、α-紫羅酮、金合歡基丙酮、檸檬醛和乙苯等7種香氣成分，濃度在6.8～ 36.1 μg/mL之間，它們可能賦予了R59菌株明顯而

不同的香氣特征，決定了發酵液香氣的豐富性[18-19]。此外，檢測到1種不利成分2-甲基丙醇，該物質有刺激性氣味，對香氣有不利影響。

2.4? 發酵產香條件的優化

液質聯用分析發現，R59菌株能產生較高濃度的苯乙醛和醋酸異戊酯，這兩種物質具有典型的果香香氣，并且在其他產香酵母中含量較少，是決定R59菌株產香特征的關鍵成分。以提高苯乙醛和醋酸異戊酯的產量為目標，研究培養基中不同的葡萄糖濃度、氮源種類、玉米漿濃度和pH對產香的影響，用HPLC測定兩種物質的產量，找到最合適的發酵條件。如圖3（A）所示，隨著葡萄糖濃度增加至30 g/L，苯乙醛的產量也升高，葡萄糖濃度繼續提升，苯乙醛產量基本保持不變;而醋酸異戊酯在葡萄糖濃度增大到20 g/L之后，產量基本保持不變。這說明苯乙醛和醋酸異戊酯的合成途徑可能有差別。有機氮源玉米漿對兩種物質的生產有明顯的促進作用，苯乙醛和醋酸異戊酯的產量分別達到336.4和129.3 μg/mL（圖3B）。如圖3（C）所示，最佳的玉米漿濃度為15 g/L;如圖3（D）所示，在pH 5.0的培養基中，苯乙醛和醋酸異戊酯的產量最高，pH過高和過低均影響香氣物質的合成，這種趨勢和酵母菌生長的pH特性相一致。因此，苯乙

醛和醋酸異戊酯最適宜的發酵條件為葡萄糖30 g/L、玉米漿15 g/L、培養基pH 5.0。在此條件下，苯乙醛和醋酸異戊酯的產量分別達到348.6和143.7 μg/mL。

2.5? 菌株發酵液在烤煙增香中的應用評價

采用R59菌株的發酵液處理煙絲并進行感官評價，如表3所示，添加發酵液的卷煙樣品，煙絲的協調性、香氣和余味指標分值均高于對照，表現為發酵樣品的果香氣更濃更飽滿，香氣的協調性也有增加，余味更干凈，抽吸品質顯著提高，而當發酵液添加量超過10 μL/g時，煙絲的抽吸品質不會再有進一步提高。此外，添加發酵液會引起卷煙刺激性和雜氣的加重，這可能和發酵液中香氣物質之外的代謝產物有關。

3? 討? 論

利用微生物開發綠色、環保的新型煙草香料，是替代化學法合成煙草香料的可行途徑。微生物種類眾多，產生的香氣也多種多樣，杜飛等[20]從茅臺酒酒糟和茯磚茶中分離出的釀酒酵母和冠突散囊菌，可以產生茶香、酒香、蜜甜香及特殊的香味，以其發酵液處理煙葉，可有效提高其感官品質。郭林青等[21]從水果表面篩選到漢遜酵母菌株，可利用煙末發酵產生花香香韻和甜香香韻物質。朱克永[22]從獼猴桃表皮分離得到酵母菌株，發酵后具有優雅水果香氣和獼猴桃自然果香。本研究從湖北省恩施土家族苗族自治州利川市煙草種植區的煙葉中分離了69株細菌和57株真菌，并從中篩選到5種產香微生物。其中R59菌株的產香能力最強，嗅香評分最高，因此對其進行了產香和應用研究。對R59菌株的菌落形態及細胞形態進行觀察，并對該菌株的ITS rDNA序列進行分析和Blast比對，將其鑒定為Aureobasidium melanogenum。

通過對R59菌株的香氣成分進行測定，檢測出11種致香成分。其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯產量均超過100 μg/mL，特別是苯乙醛的產量達到261.2 μg/mL。根據化學物質的香氣特征，苯乙醛具有水果的甜香氣，醋酸異戊酯具有香蕉、蘋果樣香氣，而苯乙醇具有典型的玫瑰香氣，并且具有增強香氣的作用，這3種組分可能是R59菌株具有較強果香且較為持久的原因。其他8種濃度較低的成分，則可能在賦予R59菌株香氣的豐富度上發揮作用。而對于不利成分2-甲基丙醇，后續可以通過原生質體融合或者誘變育種技術對菌株進行改良，以減少該物質的含量，提高香氣品質。

苯乙醇是產香酵母中較為常見的一種香氣物質，并且對香氣特征起到較大的作用[23-24]。而高產苯乙醛和醋酸異戊酯的酵母菌則較少報道，在多數產香酵母中這兩種物質的含量較低。本研究對R59菌株的發酵條件進行了研究，發現葡萄糖濃度、氮源種類和溶液pH均對苯乙醛和醋酸異戊酯的產量有較大的影響，其中最適的葡萄糖濃度為30 g/L、最優氮源玉米漿濃度為15 g/L，最適pH為5.0。在該培養條件下發酵，R59菌株的苯乙醛和醋酸異戊酯的產量分別提高30%以上和10%以上。將R59菌株的發酵液噴灑至煙絲表面后進行感官質量評價，發現噴灑10 μL/g的發酵液可有效改善煙絲的協調性、香氣和余味等。

R59菌株產香發酵成本低，生產迅速，不需要復雜的提取步驟，有較強的實際意義。而之前的研究中，發酵所產香氣物質均需單獨的有機試劑萃取過程，才能用于煙草增香[25-26]，與之相比，本研究具有明顯的工藝簡便性。

4? 結? 論

本研究篩選到具有明顯產香能力的R59菌株，對其rDNA-ITS序列分析，鑒定其為Aureobasidium melanogenum。R59菌株能夠分泌超過11種香氣化合物，主要的香氣物質為苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯，通過對其發酵的培養基組分進行優化后，進一步提升了菌株苯乙醛和醋酸異戊酯的產量。對卷煙樣品評吸結果發現，添加R59菌株發酵液能夠有效增加卷煙的協調性、香氣和余味，且最佳添加量為10 μL/g。R59菌株的產香發酵成本低，添加工藝簡單，可以作為一種提高煙草品質的香料來源。

參考文獻

[1] 唐李麗，馮文龍，熊維亮，等. 我國烤煙主栽品種的研究與思考[J]. 四川農業科技，2020（8）：79-85.

TANG L L， FENG W L， XIONG W L， et al. Study and thinking on main cultivars of flue-cured tobacco in China[J]. Sichuan Agricultural Science and Technology， 2020（8）： 79-85.

[2] 張迪，李冬，李俊營，等. 不同種植模式對烤煙葉片內在質量和致香物質的影響[J]. 湖南農業科學，2021（1）：20-22，34.

ZHANG D， LI D， LI J Y， et al. Effects of different planting patterns on the internal quality and aroma substances of flue-cured tobacco[J]. Hunan Agricultural Sciences， 2021（1）： 20-22， 34.

[3] 余金恒，許明忠，黃鋒林，等. 煙用香精香料物質研究進展[J]. 河南農業科學，2011，40（2）：16-18.

YU J H， XU M Z， HUANG F L， et al. Research progress of tobacco flavors and fragrances[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2011， 40（2）： 16-18.

[4] 許春平，孟丹丹，王充，等. 利用產香酵母發酵改善煙草薄片濃縮液品質的研究[J]. 香料香精化妝品，2019（1）：10-16.

XU C P， MENG D D， WANG C， et al. Improvement of the quality of reconstituted tobacco concentrate through fermentation by aroma producing yeast [J]. Flavour Fragrance Cosmetics， 2019（1）： 10-16.

[5] 黃永光，楊國華，張肖克，等. 產醬香風味芽孢桿菌類菌株發酵代謝產物及其酶分析研究[J]. 釀酒科技，2013（1）：41-45.

HUANG Y G， YANG G H， ZHANG X K， et al. Study on the metabolites of Jiang-flavor-producing Bacillus[J]. Liquor-Making Science & Technology， 2013（1）： 41-45.

[6] 趙琦. 低溫浸漬發酵工藝對葡萄酒釀酒品質及其代謝產物的影響[D]. 揚州：揚州大學，2017.

ZHAO Q. Effects of low temperature impregnation fermentation on wine quality and its metabolites[D].Yangzhou： Yangzhou University， 2017.

[7] FABRE C E， DUVIAU V J， BLANC P J， et al. Identification of volatile flavour compounds obtained in culture of Kluyveromyces marxianus[J]. Biotechnology Letters， 1995， 17（11）： 1207-1212.

[8] 鞏效偉，刀婭，趙偉，等. 產香酵母菌篩選、條件優化及發酵產

物在電子煙煙液中的應用[J]. 煙草科技，2020，53（2）：62-71.

GONG X W， DAO Y， ZHAO W， et al. Aroma-producing yeasts： screening， optimization and application in e-liquids[J]. Tobacco Science & Technology， 2020， 53（2）： 62-71.

[9] 楊霄，崔志峰. 酵母生物轉化生產2–苯乙醇的研究進展[J]. 應用與環境生物學報，2006，12（1）：140-144.

YANG X， CUI Z F. Progress in 2-phenylethanol production by biotransformation with yeast[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2006， 12（1）： 140-144.

[10] 胡申才，李良，李俊薇，等. 清香型白酒釀造核心功能微生物的研究與應用[J]. 中國釀造，2021，40（2）：16-19.

HU S C， LI L， LI J W， et al. Research and application of core functional microorganisms in light-flavor Baijiu brewing[J]. China Brewing， 2021， 40（2）： 16-19.

[11] WANG Z M， LU Z M， SHI J S， et al. Exploring flavour-producing core microbiota in multispecies solidstate fermentation of traditional Chinese vinegar [J]. Scientific reports， 2016， 6（1）： 1-10.

[12] 明紅梅，郭志，周健，等. 濃香型大曲中產香微生物的篩選及鑒定[J]. 現代食品科技，2015，31（4）：186-191.

MING H M， GUO Z， ZHOU J， et al. Screening and identification of aroma-producing microorganisms in luzhou-flavor daqu[J]. Modern Food Science and Technology， 2015， 31（4）： 186-191.

[13] 于迪，孔繁磊，祁靜. 高效液相色譜法檢測模型反應體系中苯乙醛濃度[J]. 食品工業，2019，40（6）：298-301.

YU D， KONG F L， QI J. Determination of phenylacetaldehyde in model reaction system by high performance liquid chromatography [J]. The Food Industry， 2019， 40（6）： 298-301.

[14] 張啟東，劉俊輝，張文娟，等. 初烤煙葉提取物中關鍵甜味成分的感官導向分析[J]. 煙草科技，2016，49（6）：58-64.

ZHANG Q D， LIU J H， ZHANG W J， et al. Sensory-oriented analysis of key sweet taste components in cured tobacco extract[J]. Tobacco Science & Technology， 2016， 49（6）： 58-64.

[15] 中華人民共和國農業部. 感官分析 味覺敏感度的測定方法：GB/T 12312—2012[S]. 北京：中國標準出版社，2012.

Ministry of Agriculture Affairs of the Peoples Republic of China. Sensory analysis—method of investigating sensitivity of taste： GB/T 12312—2012[S]. Beijing： China Standards Press， 2012.

[16] 龐登紅，董愛君，朱巍，等. 特色煙用甜香型葡萄香料的制備及其在降低卷煙自由基中的應用[J]. 生物加工過程，2012，10（2）：24-28.

PANG D H， DONG A J， ZHU W， et al. Preparation of characteristic tobacco sweet type grape perfume and its application for reducing free radicals[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering， 2012， 10（2）： 24-28.

[17] 段繼銘，曾曉鷹，劉煜宇，等. 葡萄果渣發酵煙用香料的制備及揮發性成分分析[J]. 精細化工，2009，26（8）：781-784.

DUAN J M， ZENG X Y， LIU Y Y， et al. Preparation of grape pomace as cigarette flavor by biological fermentation and the analysis of volatile composition[J]. Fine Chemicals， 2009， 26（8）： 781-784.

[18] 邢建榮，楊穎，夏其樂，等. 全果發酵生產楊梅果酒工藝條件及品質的研究[J]. 浙江農業學報，2012，24（6）：1111-1116.

XING J R， YANG Y， XIA Q L， et al. Study on the processing conditions and quality of the whole fruit fermented bayberry wine[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis， 2012， 24（6）： 1111-1116.

[19] 賈春曉，文金昉，馬宇平，等. 半制備型高效液相色譜結合氣相色譜?質譜聯用法分析卷煙煙氣中性香味成分[J]. 分析試驗室，2016，35（7）：831-835.

JIA C X， WEN J F， MA Y P， et al. Analysis of neutral aromatic components from cigarette smoke by semi-preparative high performance liquid chromatography coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2016， 35（7）： 831-835.

[20] 杜飛，喻闌清，周家喜，等. 兩種產香微生物分離鑒定及其發酵液增香煙草研究[J]. 山地農業生物學報，2021，40（1）：14-21.

DU F， YU L Q， ZHOU J X， et al. Isolation and identification of two aroma-producing microorganisms and their fermented liquid to increase the aroma of tobacco[J]. Journal of Mountain Agriculture and Biology， 2021， 40（1）： 14-21.

[21] 郭林青，樸永革，朱春陽，等. 煙草產香酵母YG-4的篩選鑒定及香氣成分分析[J]. 輕工學報，2019（5）：27-31.

GUO L Q， PU Y G， ZHU C Y， et al. Marin screening and identification of aroma-producing yeast YG-4 and analysis of its aroma components[J]. Journal of Light Industry， 2019（5）： 27-31.

[22] 朱克永. 獼猴桃發酵果酒的釀造和營養成分分析[J]. 食品研究與開發，2017，38（8）：92-95.

ZHU K Y. Brewing and nutritional composition analysis of kiwifruit fermented wine[J]. Food Research and Development， 2017， 38（8）： 92-95.

[23] 趙修報，唐育岐，劉天明，等. β-苯乙醇的研究進展[J]. 中國釀造，2011（8）：1-4.

ZHAO X B， TANG Y Q， LIU T M， et al. Research progress of β-phenylethanol [J]. China Brewing， 2011（8）： 1-4.

[24] 丁保妹，付艷麗，張曉麗，等. 發酵法合成天然2-苯乙醇的香氣品質分析[J]. 食品與發酵工業，2011，37（11）：198-202.

DING B M， FU Y L， ZHANG X L， et al. Aroma quality analysis of natural 2-phenylethanol produced by fermentation[J]. Food and Fermentation Industries， 2011， 37（11）： 198-202.

[25] SILVINA N， VER?NICA C， JULIA H， et al. QuEChERS-based method for the multiresidue analysis of pesticides in beeswax by LC-MS/MS and GC×GC-TOF[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（17）： 3675-3683.

[26] 瞿先中，王宏偉，程雷平. 超臨界萃取煙草精油條件的優化[J]. 安徽農業科學，2010，38（35）：20448-20450.

QU X Z， WANG H W， CHENG L P. Optimization of supercritical extraction conditions of essential oil from tobacco[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2010， 38（35）： 20448-20450.