苦蕎黃酮含量與SSR標記的關聯分析

石桃雄 黎瑞源 潘凡 黃娟 朱麗偉 汪燕 梁成剛

摘要：【目的】開展苦養籽?？傸S酮含量與SSR標記的關聯分析，挖掘與黃酮含量相關的分子標記，為高黃酮含量苦蕎品種的遺傳改良提供依據?！痉椒ā恳?93份苦蕎種質為供試材料，基于62對SSR引物分析了供試種質的遺傳多樣性，對總黃酮含量和SSR標記進行了關聯分析?！窘Y果】193個種質籽?？傸S酮含量的變幅為1.04%- 2.99%，變異系數為27.93%。62對引物在193個種質中共擴增出267個等位基因，每個SSR位點平均檢測到245個有效等位基因，基因多樣性為0 503，Shannon信息指數為0 942，觀測雜合度為0.513，引物多態信息量為0.74。群體結構分析將193份種質劃分為3個亞群?；趶V義線性模型（ GIM）共檢測到5個與籽?？傸S酮含量顯著關聯的SSR標記，表型貢獻率為6.3%- 12.9%，其中標記TatG0124（ 12.9%）和S6853（ 8.5%）的表型貢獻率較高?！窘Y論】供試苦蕎種質遺傳多樣性豐富，可用于苦蕎重要農藝和品質性狀的關聯分析。TatG0124和SSR6853可能是控制籽粒黃酮含量的重要位點，對改良苦蕎籽粒黃酮含量具有重要意義。關鍵詞：苦蕎;SSR標記;黃酮含量;遺傳多樣性;群體結構;關聯分析

中圖分類號：S 517

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 08088408

Correlation Between Flavonoids Content and

SSR Markers of Tartary Buckwheat

SHI Taoxiong. LI Ruiyuan. PAN Fan， HUANG Juan. ZHU Liwei. WANG Yan. LIANG Chenggang*

（ Buckwheat Industry Technology Research Center. Guizhou Normal Universily， Guiyang， Guizhou 55000I . China ）

Abstract： 【Objective】 Correlation between the flavonoids content and associated markers was analyzed for geneticimprovement studies on Tartary buckwheat. 【Method】Sixty-two SSR primer pairs were used to assess the genetic diversityof 193 Tartary buckwheat germplasms. The SSR markers closely related to the total flavonoids content were selected byassociation analysis. 【Result】The total flavonoids content of 193 Tartary buckwheat germplasms varied from l.04% to2.gg% with a coefficient variation of 27.93%. Sixty-two pairs of SSR primers amplified 267 polymorphic sites with an averagenumber of effective alleles of 2.45. The mean values of gene diversity， Shannon index. observed heterozygosity andpolymorphism information content of SSR markers were 0.503. 0.942. 0.5 13 and 0.74. respectively. The population structureanalysis divided the 193 germplasms int0 3 subgroups. Five SSR markers were determined to be significantly associated withflavonoids content by the general linear model （GLM）. The phenotypic variations ranged from 6.3% t0 12.9% with TatG0124at 12.9% and S6853 at 8.5% being the higher markers. 【Conclusion】The germplasms used in this study were diverse ingenetic variation and feasible for related genome-wide mapping on important traits of Tartary buckwheat. The loci. TatG0124and S6853， appeared to closely associate with the flavonoids content of Tartary buckwheat and were considered to bepotentially useful for breeding new varieties with high content of the functional components.

Key words： Tartary buckwheat： SSR marker; flavonoids content; genetic diversity; population structure; correlation analysis

0 引言

【研究意義】苦蕎（Fagopyrum tataricum），又名韃靼蕎麥（ Tartary buckwheat），屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）雙子葉植物，是蕎麥的兩大栽培品種之一[1]，廣泛種植于云、貴、川、藏等省區的高原和高寒地帶[2]?？嗍w是我國重要的雜糧作物之一，其籽粒含有豐富的多酚類化合物、抗性淀粉、可溶性纖維、蛋白質、氨基酸、維生素及微量元素等，可有效地預防和改善肥胖、膽結石和心血管等疾病[3-4]，在食品、保健品、醫藥等領域具有廣泛的應用前景。黃酮類化合物屬多酚類物質，苦蕎黃酮類化合物含量和種類豐富，生物活性獨特，是苦蕎保健功能最突出的一類生物活性物質，對腫瘤、“三高”（高血脂、高血壓，高血糖）和炎癥等都有一定的輔助治療作用[3-4]。因此，研究苦蕎籽粒黃酮含量的遺傳機制，挖掘與之緊密連鎖的分子標記，對苦蕎高黃酮含量專用型品種的選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前國內外學者對蕎麥黃酮類化合物的研究主要集中在其含量和組分的遺傳變異評價[5-9]、生物合成調控機理揭示及代謝途徑上一些關鍵基因的挖掘與鑒定[10]等方面?？嗍w種質資源中黃酮含量變異豐富，表現出數量性狀遺傳的特點‘69]，所以傳統育種方法很難短期改良苦蕎品種的黃酮含量。目前苦蕎數量性狀基因座（ QTL）定位還處于遺傳群體和圖譜的構建階段[ll]，還沒有和黃酮含量關聯的QTL或分子標記的報道。關聯分析是解析數量性狀、挖掘有利等位基因、開發與目標性狀緊密連鎖分子標記的有效手段，在作物遺傳育種中發揮著重要作用。近年來，隨著苦蕎參考基因組的公布[12]，Zhang等[13]1對510份苦蕎種質黃酮含量和重要農藝性狀進行了全基因組關聯分析，推測FtUFGT3和FtAP2 YT1可能分別是調控籽粒黃酮含量積累和粒重的關鍵基因?！颈狙芯壳腥朦c】SSR標記是關聯分析常用的分子標記之一。隨著測序技術的發展和測序成本的降低，蕎麥屬植物SSR標記已被大規模開發[14-18]，主要用于苦蕎種質資源遺傳多樣性和群體結構的研究[19-24]。但目前SSR標記與苦蕎黃酮含量關聯分析的研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究調查了來自我國12個省區的193個苦蕎審定品種、地方品種和育種品系的籽?？傸S酮含量，利用SSR標記關聯作圖法尋找可能與籽粒黃酮含量緊密連鎖的標記，以期為分子標記輔助選育高黃酮含量苦蕎品種提供依據。

1材料與方法

1.1供試材料

搜集來自全國不同省區的審定品種、育種品系和地方品種等193個苦蕎種質作為試驗材料，其中貴州139個、四川16個、云南13個、陜西7個、山西6個、江西2個，甘肅和湖南各3個，遼寧、內蒙古、寧夏和西藏各1個。193個苦蕎資源由36個審定品種、75個地方品種和82個育種品系組成。

1.2田間種植

供試種質于2016年種植于貴州師范大學柏楊試驗基地。每個種質種植四行區，行長2.0 m，行間距為0.33 m，常規田間管理。籽粒成熟后，按小區收獲，脫粒、風干至恒重。

1.3籽?？傸S酮含量的測定

稱取風干后的飽滿籽粒30 9充分研磨，稱取0.1000 g粉末置于10 mL離心管中。采用75%的甲醇60℃恒溫水浴浸提，0.1 mol·L-l AIC13-1.0 mol·L-lKAc顯色，在波長420 nm處測定吸光度（新世紀T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司），蘆丁標準曲線的繪制和黃酮含量的具體測定過程參照呂丹等[8]的方法和步驟。

1.4 SSR基因型檢測和遺傳多樣性分析

在每份種質種植小區中混合采集幼嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根）提取DNA。對本課題組前期合成的350對SSR引物進行篩選，包含了150對Genic-SSR引物和200對Genomic-SSR引物，分別以“S”和“TatG”開頭命名，引物信息詳見黎瑞源等[25]的報道。PCR反應體系為10 uL，包括：DNA模板（ 50ng·uL-l） 2.0 uL，2×Taq PCR MasterMix 5 uL，上下游引物（ 100 ng·uL-I）各0.5 uL，ddH20 2.0 uL。

PCR擴增產物在2000 V，80 W，100 mA/板的電泳條件下，采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳后，膠板用0.15% AgN03染色15min，1.5% NaOH顯影，具體步驟參考楊美[26]的試驗方法。膠板晾干后讀帶，將可重復的、清晰的條帶記為1，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為0，建立原始數據矩陣。利用PowerMarker V3.25軟件計算每對引物擴增的等位基因數（ Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon信息指數（I）、觀察雜合度（Ho）和基因多樣性（He）及多態性信息量（ PIC）。

1.5群體結構分析

利用STRUCTURE 2.2軟件對供試種質SSR數據矩陣進行基于數學模型的亞群劃分。群體結構K值設定為1～9，每個設定的K值進行10次獨立運算，Burn-in與MCMC周期均設定為100000次。將STRUCTURE 2.2軟件的運算結果先導入在線T具STRUCTURE HARVESTER（ http：//taylorO.biology.ucla.edu/structureHarvester/）計算統計值AK，確定最有可能的亞群數;再導入在線工具CLUMPAK（ http：//clu-mpak.tau.ac.i1/）計算群體結構。最后將計算結果導入到EXCEL 2019完成結果圖的繪制。

1.6黃酮含量與SSR分子標記的關聯分析

使用軟件TASSEL 3.0計算、繪制標記連鎖不平衡（ LD）配對檢測的矩陣圖，觀測LD水平，Permutation設置1000次。使用該軟件的廣義線性模型（ GIM），將各個材料相應的Q值作為協變量進行群體矯正，將黃酮含量與62個SSR標記基因型數據進行回歸分析，標記與表型性狀的顯著性水平設定為p=0.05。TASSEL 3.0軟件中表型變異解釋率的計算公式為：R 2-SSM/SST，其中SSM為標記基因型間平方和，SST為總平方和。

2 結果與分析

2.1苦蕎種質SSR標記的遺傳多樣性分析

利用從350對SSR引物中篩選到的多態性較好的62對引物，對193個苦蕎種質進行擴增（圖1），共檢測H1 267個等位變異，每個SSR標記平均檢測到4.31個等位基因（ Na），2.45個有效等位基因（Ne），范圍分別為3～9和1.02～7.28。觀測雜合度（Ho）平均為0.503，范圍為0～0.964?；蚨鄻有裕℉e）平均為0 513，范圍為0.021～0.863。Shannon信息指數（I）平均為0.942，范圍為0.065～2.031。引物多態信息量（ PIC）平均為0.74，范圍為0.20—0.91。在62個SSR標記中，有35.5%的標記至少能檢測到5個以上等位基因，98.3%的標記PIC> 0.5，64. 5%的標記He> 0.5（表1），表明供試的193個苦蕎種質具有豐富的遺傳多樣性。

2.2苦蕎種質群體結構的分析

利用62個SSR標記對供試種質進行群體結構分析，在K=3時，AK值最大（圖2），因此將193個苦蕎種質劃分為3個亞群，命名為POPI、POP2和POP3（圖3），分別包含88、90和15個種質。對各亞群的遺傳多樣性參數的統計可以看出，POPI是遺傳多樣性最豐富的亞群，平均每個SSR標記檢測出4.21個Na，He為0.513，，為0.943。其次是POP2，平均每個SSR標記檢測出3.74個Na，He為0.484，，為0.870（表2）。亞群POP2與POP3之間的Nei's遺傳距離最小，為0.026;POPI與POP3之間的Nei's遺傳距離最大，為0.076。3個亞群之間的成對Fst值平均為0.027;亞群POP2和POP3之間的成對固定系數Fst最小，為0.014;POPI和POP3之間的成對Fst值最大，為0.037（表3），表明劃分的3個亞群間遺傳分化程度低。

2.3連鎖不平衡分析

對62個SSR標記形成的1891個成對組合進行連鎖不平衡（ LD）分析，整體共有644個組合存在顯著（P<0.05）的LD，占總組合數的34.1%，而三個亞群POP1、POP2和POP3中，存在顯著的LD成對標記組合數分別只有90（4.8%）、206（ lO.9%）和97（5.1%）個（表4），遠少于在全體種質中檢測到的數目，表明群體結構會影響連鎖不平衡的分析。

2.4黃酮含量的變異和關聯分析

193個苦蕎種質籽粒黃酮含量平均為2.11%，變幅為1.04%～2.99%，變異系數為27.93%。偏度和峰度分別為0.29和1.17，說明籽粒黃酮含量呈近似的正態分布。以上結果表明，供試種質籽粒黃酮含量的變異豐富，可以進行關聯分析。

對黃酮含量與62個SSR標記進行基于群體結構的關聯分析，檢測到5個與黃酮含量顯著關聯的SSR標記（表5），共解釋43.30%的表型變異率。其中TatG0124解釋了12.g%的表型變異率，是5個位點中貢獻率最大的。其次是S6853，解釋了8.5%的表型變異率。

3討論與結論

群體具有豐富的遺傳和表型變異，且內部沒有明顯的群體結構是關聯分析成功的關鍵條件[27]。群體的遺傳多樣性與群體的大小、來源、標記數量和引物的類型等因素有關。有效等位基因數目（ Ne）、期望雜合度/基因多樣性（He）、Shannon信息指數（I）和多態信息量（PIC）等參數能有效地度量和比較不同群體的遺傳多樣性。一般認為He> 0.5，群體沒有高強度的選擇，擁有豐富的多態性，He< 0.5的群體遺傳多樣性低;PIC> 0.5的位點為高度多態座位[28]。本文利用62對SSR引物分析了193個苦蕎種質遺傳多樣性，其，和PIC平均分別為0.942和0.74，高于山西地方品種（He和PIC的均值分別為0.4475和0. 3869）[29]、云南地方品種（He和PIC的均值分別為0.508和0.44）[20]、我國審定品種（PIC均值為0.44）[19]和國內外苦蕎種質（PIC均值為0.40）[16] SSR標記的遺傳多樣性，說明本研究中的193個苦蕎種質的遺傳多樣性豐富。62對SSR引物中11對來自苦蕎基因組序列，其Ne、I、He和PIC均值分別為3.837、1.427、0.707和0.855;51對來自苦蕎轉錄組序列，其Ne、I、He和PIC分別為2.154、0.837、0.471和0.719?？梢?，基因組SSR位點的多態性程度要高于轉錄組SSR位點。62個引物中，有35.5%的引物至少能檢測到5個以上等位基因，98.3%的引物PIC>0.5，64.5%的引物He> 0.5，這些等位基因豐富、高度多態性的引物可有效地用于今后苦蕎種質遺傳多樣性的研究。

群體結構是指一個群體內存在亞群的情況，群體結構會增加染色體間的LD，造成目標性狀和基因位點的偽關聯[27]。本研究利用群體結構分析將193個供試苦蕎種質劃分為3個亞群，亞群間的成對固定系數Fst為0.014～0.037，表明3個亞群間遺傳分化程度低。62個SSR標記之間的LD分析顯示，三個亞群POPI、POP2和POP3間存在顯著的LD的標記組合數分別有90、206和97個，數目遠少于在全體材料中檢測到的644個，這表明通過群體結構可對供試種質進行有效的劃分，降低目標性狀與標記關聯的假陽性，提高關聯分析的準確度。以上結果為利用該群體進行苦蕎重要性狀的關聯分析提供了重要參考。

本研究中193份苦蕎種質籽?？傸S酮含量變幅為1 .04%～2.99%，變異系數為27.93%，黃酮含量的變異程度大于Gupta等[30]報道的印度喜馬拉雅地帶的195份苦蕎種質和劉三才等[6]調查的來自我國四川、云南、貴州、寧夏、湖南和山西等地的76份苦蕎種質籽?？傸S酮含量的變異程度，也大于呂丹等[8]和鄭冉等[9]報道的苦蕎遺傳群體籽?？傸S酮含量的變異程度。本研究對供試驗種質籽粒黃酮含量與62個SSR標記進行了基于群體結構的關聯分析，定位到了5個與籽粒黃酮含量顯著關聯的SSR標記，共解釋43.3%的表型變異率。其中TatG124（ 12.9%）和SSR6853（ 8.5%）解釋的表型變異率較大，由此推測SSR0124和SSR6853是控制籽粒黃酮含量的重要位點，可進一步驗證開發為實用性標記，將為分子標記輔助選育高籽粒黃酮含量苦蕎品種提供依據。

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（責任編輯：于洪杰）

收稿日期：2021-0425初稿;2021-0629修改稿

作者簡介：石桃雄（ 1980-），女，博士，副教授，研究方向：蕎麥種質資源保育及創新（E-mail： shitaoxiong@126.com）：共同第作者：黎瑞源

（ 1980-），男，博士，副教授，研究方向：生物信息學（E-inail： ruiyuan li@126.coin）

*通信作者：粱成剛（ 1985-），男，博士，副教授，研究方向：蕎麥遺傳育種（E-mail： jesselcg@163.com）基金項目：圍家重點研發計劃項日（2019YFDl001300. 2019YFDl001301）：國家自然科學基金項日（31960125）：貴州省科技支撐計劃項日（黔科合ZC[2019]2298）;貴州省蕎麥種質資源保育及創新重點實驗室建設基金項日（黔教合KY[2017]002）;貴州師范大學博士啟動基金項日（11904/0514027）