外植體差異對植物組培苗無性快繁的影響

曹璐瑤 李晶宋來慶王書君杜曉云*

（1煙臺大學生命科學學院，煙臺 264010；2山東省煙臺市農業科學研究院，煙臺 265500）

植物組培技術在商業市場上用于高效率且快速地繁殖植物或培育新的植物。該技術適用于各種經濟植物或觀賞植物，以及其它植物的微繁殖[1]。植物組培技術相對于種子育種可以更好地保留母本的優良性狀，縮短育種年限，還可以通過超低溫保存的植物組織，對稀有植物實現再生利用[2]。同時，也廣泛應用到果樹脫毒苗培育、轉基因育種等多項農業技術中，因此大力發展植物組織培養意義重大。能否成功地進行植物組織培養，外植體的選擇、植物品種以及外植體不同，增殖系數存在較大差異[3]。本文分析總結了不同外植體的差異性對植物組織培養的影響，可為植物組培工作以及實驗研究提供相關參考和借鑒。

1 植物的組織培養

植物組織培養是人為地在滅菌的環境中，以細胞的全能性為原理，通過植物的葉片、根尖、莖等植物器官或植物組織，在適宜的環境下，離體培養培育出新的愈傷組織，再進行生根培養，從而發育成完整的植株[4]。

1.1 外植體的分類

植物在進行無性組織培養時，通常是選取植物的某些外植體進行無性快繁培養，如植物的葉片、胚、種子、莖段、根尖等來進行誘導分化。禾本科水稻類的作物常使用成熟胚和幼穗作為外植體，玉米常用幼胚和成熟胚，而小麥常使用的是幼穗和幼胚[5]。喬木類植物多使用莖段或嫩葉作外植體，且效果較好。在杜仲的組織培養研究中，常用莖尖作外植體建立無性快繁體系[6]，楊樹則多使用莖段或葉片為外植體進行誘導分化[7]。

2 外植體對組培苗無性快繁的影響

在植物的組織培養中，外植體的選擇對實驗過程中的現象和結果有重要的影響。從理論上講，由于細胞全能性，無論選擇植物體的哪一個部位，都能誘導出新的再生組織，但在實際的組培實驗過程中，外植體誘導出的愈傷組織或不定芽，會因為外植體材料的差異性而不同。并且外植體采摘的季節、幼嫩程度、種類等因素，都會影響實驗過程中愈傷組織的褐化率、死亡率及組培苗的生長等。因此，在組培實驗中，了解外植體的種類及其生理狀態等是否適合實驗，也是非常重要的步驟[8]。

2.1 不同外植體材料消毒效果

外植體材料的消毒處理，是植物組培實驗過程中的關鍵一步，影響愈傷組織的褐化率或誘導率，進而影響組培苗的存活率。不同的外植體會因為形狀不一，導致與消毒劑接觸的面積不同，一定程度上影響外植體消毒后的滅菌效果。鐘俊橋等在無患子組織培養的消毒過程中，以嫩葉片和幼嫩莖段作為外植體，采用相同的方法處理這兩種外植體材料，結果表明，嫩葉片的消毒效果最佳，能保證較高的存活率，且實驗過程中褐化率為零[9]。在杉木苗組織培養的實驗中，饒寶蓉等人用已篩選出的消毒方案處理杉木的去針莖段、莖段、莖尖，實驗結果表明，莖尖的萌芽率最低且感染率和死亡率最高，但去針莖段則相反，所以該實驗綜合萌芽率、死亡率等指標，以去針莖段的消毒效果最佳，更有利于實驗順利進行[10]。

不同外植體所帶菌落數量的不同，也會影響實驗中外植體的滅菌效果。韓瀛以相同的方法消毒處理半日花嫩葉片和熟葉片，結果表明，嫩葉的污染率更低，分析原因主要是因為幼嫩葉片在空氣中暴露的時間不長，未受到細菌的長期侵入，攜帶菌落數量較少，通過消毒劑容易達到良好的滅菌效果[11]。因此在接種過程中，要根據實驗條件或預實驗的結果選取攜帶污染菌少或滅菌效果好的植物器官作為外植體材料，從而保證實驗可以良好地進行。

2.2 外植體種類對外植體誘導的影響

外植體的種類較豐富，會導致所誘導的實驗結果有所差異。如林木類的植物，大多數以葉片、莖段、胚等作為外植體，可以完成分化誘導的過程，從而培育出新的植株個體，但多數研究表明，使用帶芽莖段為外植體材料，可獲得最佳的誘導效果，在這些植物組培實驗中，以帶芽莖段來進行誘導分化，具有誘導率高、褐化率低的優勢[12-14]。懷慧明等在紅花玉蘭愈傷組織誘導的實驗中，選用種子、腋芽、葉片、帶芽莖段等4種外植體進行誘導處理，結果表明，以帶芽莖段為外植體時，愈傷組織的褐化率較低，且組培苗的成活率較高，所以帶芽莖段為紅花玉蘭組織誘導實驗中最佳的外植體材料[15]，這與唐軍榮等研究結果一致[16]。

木犀科類植物的組培實驗中，最常用的外植體也是帶芽莖段[17]。軟棗獼猴桃的組培快繁實驗結果表明，莖段誘導出愈傷組織的時間要短于葉柄、葉片等，而且可以降低其褐化率，提高組培苗的生存率[18]。在同源四倍體臺灣泡桐的組培實驗中，以葉片和葉柄作外植體材料，葉片誘導率最高達90%，而葉柄的誘導率僅為60%，并且葉片所誘導的愈傷組織生長狀態相對較好，因此該實驗認為葉片為該泡桐品種的最佳外植體[19]。

除了葉片、莖段等作為外植體材料，種胚也可以作為外植體材料來誘導分化。衛矛的相關組培研究表明，衛矛屬植物的莖段、葉片、胚等都能完成誘導分化的過程，繼而獲得新植株，但以腋芽莖段和種胚作為外植體，較容易誘導出新植株，并且再生率較高，而葉片所誘導出的愈傷組中，較難分化出不定芽[20]。因此，研究出最適合自身誘導的外植體種類是提高組培苗的質量和數量的關鍵。

2.3 外植體年齡對外植體誘導的影響

植物的組培實驗中，外植體的誘導效果除了受自身種類的影響外，還與外植體的年齡有關。研究表明，幼嫩外植體的誘導效果在一定程度上比成熟的外植體更好。相關實驗表明，大多數基因型的西瓜外植體在苗齡為2～5 d時不定芽誘導率較高[21-22]。在微型月季誘導實驗中，馮歡以葉片、葉柄 、莖段作為外植體進行誘導時，葉片誘導效果最好，并且以葉片作為外植體時，隨著葉齡增大，其誘導率增高，直到葉齡為12 d，誘導率達到峰值，之后誘導率又隨著葉齡的增大而下降[23]。該實驗表明，幼嫩葉片比成熟葉片更適合作為外植體材料，且在一定時間內，其葉片誘導率和葉片年齡成正比。張玲玲在相同的消毒條件下，對比研究垂絲海棠的幼嫩莖段和生長成熟莖段的消毒后的誘導效果，結果顯示，幼嫩莖段發生誘導后的褐化率和污染率明顯低于成熟莖段，原因可能是幼嫩外植體受外界環境污染的影響較小，并且較易清洗。該實驗表明，以幼嫩外植體作為誘導材料，實驗效果會更好，可提高愈傷組織或不定芽存活率[24]。

在大麥的組織培養中，認為大麥幼胚是最佳的外植體材料，因為其幼胚中有再生能力較強的盾片，雖然大麥的成熟胚在植株再生上也有一定的效果，且取材便利，但是其成熟胚誘導的愈傷組織質量較差，大多不能成功培育出組培苗[25]。

鄭文靜等人使用8個品種的水稻來探究水稻不同外植體組織培養的差異性，實驗顯示以成熟胚作外植體，誘導率最高達80%，而以其它的作外植體誘導率小于40%。實驗還表明，成熟胚作外植體時誘愈率最高，且水稻后代的有利變異率最高[26]。洪青梅等采用相同的消毒試劑和相等的時間，處理金都一號火龍果，實驗結果顯示幼嫩莖段褐死率較高，達到66.7%，而近成熟莖段的褐死率則為53.3%，并且其污染率也低于幼嫩莖段的污染率，因此該實驗認為，近成熟莖段更適合作金都一號火龍果組培研究的外植體材料。在植物的組培實驗中，同種外植體材料的誘導效果與年齡有著很大的關系，在掌握最佳外植體的種類基礎上，了解外植體最合適的年齡，對實驗有著很大的促進效果。

2.4 不同外植體對愈傷組織和不定芽生長狀態的影響

植物的組培實驗中，外植體的不同也會影響愈傷組織和不定芽的生長，只有適合的外植體，才能誘導出生理狀態健康、顏色良好的愈傷組織或不定芽。在五指毛桃的組培實驗中，將葉片、葉柄、莖段接種于同種培養基上，結果表明，葉柄分化出的愈傷組織呈淡黃色，誘導時間長，誘導率低，后期未分化出不定芽；莖段也未誘導出愈傷組織或不定芽，并且存在黃化現象；只有葉片誘導的愈傷組織體積大，呈綠色，且出現少量的分化現象，表明葉片誘導的愈傷組織生理狀態更好[27]。在垂絲海棠組織培養中，張玲玲以幼嫩的莖段、葉片、花瓣作為外植體材料，出愈率情況為葉片＞莖段＞花瓣。雖然葉片出愈率最高，愈傷組織生長速度比較快，體積較大，但其組織結構較為松散，花瓣誘導出的愈傷組織顏色較淺。而莖段出愈率雖略低于葉片，但愈傷組織結構緊致，顏色狀態也比較好，綜合考慮，莖段是本次實驗中最佳的繼代增殖材料[24]。

在櫻花快繁組培實驗中，以莖段和葉片作外植體進行誘導實驗，發現莖段和葉片的成活率和誘導率差別不大，但是二者誘導形成的愈傷組織狀態不一樣，葉片誘導的效果更佳，容易誘導出不定芽，所以以葉片為外植體時，實驗結果更佳[28]。不同的外植體對誘導后的愈傷組織和不定芽的生長狀態有著不可忽視的影響，要誘導出生理健康、顏色飽滿的愈傷組織或不定芽，需摸索出組培中最適合植物自身的外植體。

2.5 外植體不同對組培苗無性快繁的其它影響

外植體不同還在其它方面影響組培苗的無性快繁。有些植物中，不同外植體最佳生長的時間和狀態不一樣，因此獲取的條件不相同，優先考慮獲取容易的外植體，以節省人力和財力。在花毛茛的組培實驗中，常采用葉片為外植體對其進行誘導，主要是因為花莖在生殖階段才有，且生長年齡適合的花莖誘導效果才好，而用葉片來誘導，可以不受時間或季節的限制[29]。李國樹在葡萄的組培實驗中，發現莖尖作外植體材料的誘導效果優于莖段、根尖、葉柄等。實驗還表明，外植體的大小通過影響誘導愈傷率，對植物的誘導效果產生影響，即誘導愈傷率和外植體的大小相關。外植體的大小要適宜，過大易產生污染，太小易發生褐化[30]。其次，同樣類型的外植體也會因采摘時間不同，對組培苗產生影響。大多數研究表明，春季取外植體材料較為適宜。春季植物生長旺盛，細胞有活力，獲得的外植體誘導愈傷組織，滅菌效果和誘導率更高[31-33]。崔杰在金葉加拿大楊組織培養及再生體系研究的實驗中發現，3月中旬采集的外植體材料啟動率最高，其莖段和葉片的啟動率分別達到86.67%和78.33%，并且外植體材料的污染程度最低，分別為16.67%和18.3%[34]。

3 總結

組織培養技術可以大大縮短植物培育的時限，但是具體某一種植物選擇哪種外植體，在實驗過程中，會造成事倍功半或是事半功倍的效果。因此選擇外植體，應考慮多方面因素。

3.1 植物的外植體種類比較豐富

每種植物所能用的外植體種類是比較豐富的，但外植體種類的不同可能會產生較大的實驗結果差異，只有最佳的外植體材料才能獲得最好的效果。不同植物可以參考前人的同科同屬或者同種的植物組培實驗來確定自己試驗中的最佳外植體，也可以根據自己前期的預實驗來進行選擇，使后期的實驗達到預期的效果。

3.2 外植體的年齡會影響植物組培實驗的誘導效果

部分植物幼嫩的外植體更適合作誘導分化的材料，因為這類外植體和空氣接觸時間不長，攜帶細菌少，滅菌率高，同時生命力比較活躍，更容易誘導分化出愈傷組織或不定芽。而有的植物成熟的外植體更適合自身的組培實驗，因為，成熟的外植體生命力比較強，較能抵御消毒劑的傷害，實驗過程中其褐死率相對更低。

3.3 外植體的細胞活力和污染程度因外植體的采集時間不同而不同

大多數研究表明，春冬季節比較適合采集外植體材料，對其實驗的消毒效果、誘愈率有一定的幫助。

3.4 外植體的大小決定其實驗的滅菌效果和褐化率

外植體的大小需要根據外植體和植物的種類來決定。