小型節肢動物無形態損傷提取基因組DNA的研究進展

范海頁，陳慧林，朱永航，王嚴，王若航，趙薇，陶香林，孫恩濤

皖南醫學院檢驗學院，安徽 蕪湖 241002

近年來，DNA條形碼技術發展迅速，在物種的鑒定分析、系統發育分析、遺傳多樣性分析等研究中應用廣泛[1]。而樣本DNA的提取是獲取DNA條形碼的關鍵步驟，也是進行后續相關研究的基礎[2]。樣本基因組DNA的提取分為取樣和提取兩個重要部分，依據取樣方法的不同，可分為傷害性取樣和無形態損傷性取樣。其中，傷害性取樣均勻化研磨樣本，破壞了樣本重要外部形態，無法進行后續標本的回收和驗證[3]；而無形態損傷性取樣保留了憑證標本，有效彌補了傷害性取樣的不足[4]。小型節肢動物因體型微小，目前常采用傷害性取樣方法，導致現有基因數據庫中大多數小型節肢動物序列因缺乏相應的憑證標本，難以進行鑒定和錯誤修正[4]。因此，小型節肢動物無形態損傷提取基因組DNA的研究越來越受到重視。

本文概述了已報道的小型節肢動物(體長0.1～10.0 mm)的無形態損傷取樣方法，對比了小型節肢動物不同DNA提取方法的優缺點，為進一步優化改進，探索出更簡單、高效的無形態損傷性基因組DNA提取方法奠定基礎。

1 小型節肢動物無形態損傷取樣方法

無形態損傷性取樣指在不破壞實驗樣本重要外部形態結構的情況下，采集樣本微量組織，抽提樣本內容物或收集樣本脫落的羽毛、糞便、尿液、卵等含有遺傳信息的樣品[5]。已報道的小型節肢動物無形態損傷性取樣方法有微量組織取樣、內容物取樣、糞便取樣和蛻皮組織取樣。

1.1微量組織取樣 微量組織取樣是指在保證憑證標本形態完整性的同時，選取樣本微量組織備取DNA的取樣方法。閆振天等[6]利用蚊附肢成功提取基因組DNA，用于分子鑒定和基因型研究。胡佳等[7]對蠅類后足1/5跗節進行研磨，成功獲得基因組DNA，用于物種鑒定。

微量組織取樣所需樣本組織量較少，能夠較好地保護樣本重要外部形態結構，為后續形態學鑒定奠定了良好基礎。但是，微量組織取樣所提供的DNA含量較少，可能無法進行有效的分子生物學研究。此外，對于稀有物種，即使只存在小部分的形態損壞，也可能造成樣本形態學信息的巨大損失[8]。

1.2內容物取樣 內容物取樣是指不破壞樣本重要外部形態結構的前提下，僅消化樣本的表皮層[9]，獲取內容物備取DNA的取樣方法。高艷等[4]通過改進消化液濃度，有效縮短了昆蟲表皮層的消化時間，探索出一種適用于表皮薄、身體柔軟的小型節肢動物(跳蟲)的無形態損傷基因組DNA提取方法。單振菊等[10]利用幾丁質酶溶液消化甲螨厚幾丁質外殼，建立一種無損傷提取具有厚幾丁質外殼的小型節肢動物基因組DNA的方法。

內容物取樣僅消化表皮層，極大程度地保護了樣本形態，是小型節肢動物無形態損傷取樣的有效途徑。但是，不同類型的小型節肢動物表皮構成不完全相同[9]，且已報道的消化方法應用于其他類群的實際效果未知[11]。因此，內容物取樣方法的更廣泛應用，仍需進一步驗證和改進。

1.3糞便取樣 糞便取樣指在物種的活動區域內采集其糞便樣品，備取DNA的取樣方法。新鮮糞便含有腸道脫落細胞，提取DNA比較簡單[3,5]，且糞便取樣對實驗樣本不造成任何損傷，是一種具有潛在價值的取樣方法[12]。Zhu等[13]成功對5種葉螨糞便的16 SrRNA基因進行深度測序，探討其細菌群落。但是，由于糞便長期暴露于外界環境中，極易造成DNA降解，影響DNA的提取效果[12]。Lefort等[14]利用金龜子糞便進行無損傷DNA的提取，結果顯示，超過88%的糞便成功提取基因組DNA，少量存放7～8天的糞便未能成功提取。同時，糞便保存方法、預處理操作、提取方法等因素也會影響DNA提取效果，并且糞便中常含大量抑制Taq酶活性的物質，可能對后續PCR擴增產生影響[15]。

目前，糞便取樣更多地應用于哺乳類、爬行類、鳥類或體型較大的節肢動物。Scriven等[16]從大黃蜂糞便中成功提取到基因組DNA，應用于群體遺傳學研究。相較而言，小型節肢動物因糞便樣品小，獲取和保存難度較大[5]，糞便取樣法的廣泛應用存在困難，需進一步優化拓展。

1.4蛻皮組織取樣 蛻皮組織取樣指采集物種蛻皮成分作為備取DNA的取樣方法。蛻皮組織被氣管、腺管及前、后腸內膜等部分組織附著，可從中提取DNA[17]。目前蛻皮組織更多被運用于中大型節肢動物的基因組DNA提取，例如蜜蜂[18]，在小型節肢動物的應用相對較少，例如蚊[19]、金龜子[14]。

由于小型節肢動物的體型較小，產生的蛻皮組織樣本小[20]，通常難以采集。且蛻皮組織暴露時間過長可能導致DNA降解，影響DNA提取效果。此外，土壤小型節肢動物的蛻皮組織可能存在抑制PCR反應的物質，影響后續PCR擴增[21]。

2 小型節肢動物無形態損傷性DNA提取方法

小型節肢動物無形態損傷取樣后，進行后續DNA提取。目前，常被報道證實的小型節肢動物無形態損傷的DNA的提取方法有Nacl-Tris-EDTA緩沖液(sodium-chloride-Tris-EDTA buffer,STE)法、Chelex-100法、CaCl2緩沖液法和試劑盒法。

2.1STE法 STE法提取DNA是通過STE裂解液和蛋白酶K的共同作用，實現基因組DNA的提取。該方法操作簡便，所用試劑少且成本低廉[23]，被廣泛應用于小型節肢動物的DNA提取[22-25]。許薇等[22]采取STE法提取腐食酪螨DNA，成功用于腐食酪螨的分子鑒定。近年來，有相關研究者將此法創新應用于小型節肢動物的無形態損傷提取。張利娟等[25]通過用無菌微針穿刺和STE法相結合，成功實現無形態損傷從單頭薊馬中提取基因組DNA。

雖然STE法被報道廣泛用于小型節肢動物基因組DNA的提取，但運用于小型節肢動物DNA的無形態損傷提取的報道卻相對較少。

2.2Chelex-100法 Chelex-100法指在高溫、堿性及低離子強度條件下，使細胞膜破裂、蛋白質變性，再通過離心去除Chelex顆粒及其螯合物質，實現基因組DNA的分離獲取[26]。該提取方法簡單、安全，且操作過程未涉及溶液轉移，減少了實驗污染和樣本損失，適用于微量DNA的提取[6]，且作為PCR反應模板具有良好的效果[6,26]。但Chelex-100法提取到的DNA純度不高，應用在限制性內切酶片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)這類精細程度更高的分子實驗時存在局限性[26]。

近年來，多位學者研究證明，Chelex-100法是簡單而有效的小型節肢動物DNA提取方法，可用于提取如棉蚜[27]、甲螨[28]、麗蚜小蜂[29]等多個物種的基因組DNA。但是，目前Chelex-100法被報道應用于小型節肢動物的無形態損傷提取DNA仍相對較少。

2.3CaCl2緩沖液法 CaCl2緩沖液法通過CaCl2裂解緩沖液和蛋白酶K的共同作用，實現基因組DNA的粗提取。近年來，CaCl2緩沖液法是節肢動物無形態損傷基因組DNA提取常用的方法之一。Gilbert等[30]利用該方法成功擴增了50年前甲蟲舊樣本的COⅠ和28S rDNA序列基因，且有效保留了甲蟲外部形態。此后，多位學者對該方法進行改進，用于研究不同節肢動物無形態損傷性DNA提取的實驗[8，31]。Suaste-Dzul等[31]在此方法的基礎上進行試劑濃度的改進，并成功用于3種中小型節肢動物無形態損傷提取。

迄今，CaCl2緩沖液法被多位研究者證實適用于節肢動物的無損傷性基因組DNA提取，但研究對象多數為大中型的節肢動物，有關小型節肢動物的研究報道較少。高艷等[4]對CaCl2緩沖液法的消化液濃度及純化方法進行改進，有效減少了實驗步驟，進一步提高了DNA質量，更大程度提高了小型節肢動物DNA提取的成功率，使CaCl2緩沖液法更加適用于小型節肢動物的無損傷性DNA提取。

2.4試劑盒法 試劑盒配備了提取DNA所需的成套試劑和用品，可直接用于提取基因組DNA，操作便捷精準，排除了人為配置試劑的誤差，并減少了試劑的浪費。葉琳雄等[32]在研究中用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒結合蛋白酶K對粉蚧進行基因組DNA的無形態損傷提取，獲得了高質量DNA。

然而，現階段DNA提取試劑盒種類比較多，不同試劑盒提取速度與效果也存在較大差異[3]。魏亦寒等[35]在粉蚧DNA提取方法的探究中，分別使用GenMag Bio動物細胞組織/細胞基因組磁珠法試劑盒和Gene JET Genomic DNA純化試劑盒法對粉蚧成蟲進行基因組DNA提取，獲得不同處理條件下的粉蚧DNA，使用前者試劑盒提取的DNA質量均優于后者。因此，選用試劑盒法提取小型節肢動物DNA時需關注其適用性和實用性。其次，試劑盒價格普遍較高，是限制其廣泛應用的重要因素。

3 總結與展望

近年來，無形態損傷性DNA提取在小型節肢動物分子生物學、分子遺傳學、系統地理學、行為生態學、動物保護學等領域中的運用具有重要意義[3]?；跓o形態損傷性取樣所提取的基因組DNA能夠成功擴增并測序，同時還保證了實驗樣本重要外部形態結構的完整性，為后續憑證標本的回收奠定良好基礎。但目前無形態損傷取樣應用于小型節肢動物時仍存在一定局限性，如體型太小致使取樣困難，適用性局限，需進行實驗技術的不斷優化等。此外，還有一些提取動物基因組DNA的經典方法，例如酚氯仿法、SDS法、CTAB法、鹽析法，能否應用于小型節肢動物的無形態損傷DNA的提取，仍需更多探索和驗證。因此，小型節肢動物無形態損傷提取DNA方法的優化改進和創新，是未來無損傷提取研究的發展趨勢之一。

本研究總結整理了目前常用的小型節肢動物的DNA無形態損傷取樣方法，對比了小型節肢動物不同DNA提取方法的優缺點，為后續的相關研究奠定了理論基礎，為更好地開發利用無形態損傷提取小型節肢動物DNA提供了有力工具。