白刺鏈霉菌CT205誘變及其制劑對芹菜根腐病的生防效果

從炳成 王小姣 李夢雅 文麗 王世梅

摘要：以生防菌株白刺鏈霉菌CT205為材料，通過誘變選育高效突變菌株，并探索其生物制劑對芹菜根腐病的防控效果。菌株CT205經UV-LiCl復合誘變獲得一株遺傳穩定、相對高效的突變菌株U-L-4，液體發酵其活性物質產量達到42 mg/L，較野生菌株提高55.56%。利用突變株U-L-4固體發酵，制備生物有機肥，通過田間試驗防控芹菜土傳病害，結果表明，施用放線菌生物有機肥可有效防控芹菜根腐病，顯著促進植株生長，芹菜產量增加75.00%，芹菜根際病原真菌-尖胞鐮刀菌數量顯著降低，改善了芹菜根際微生物群落組成。研究結果可為生防制劑防控土傳病害提供理論依據。

關鍵詞：誘變育種;生物防控;芹菜根腐病;微生物群落;白刺鏈霉菌

中圖分類號： S436.36? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0138-05

收稿日期：2021-03-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：41671256）;江蘇省泰州市科技支撐計劃（農業）項目（編號：TN202015）。

作者簡介：從炳成（1995—），男，山東濱州人，碩士研究生，研究方向為土壤微生物。E-mail：2019103123@njau.edu.cn。

通信作者：王世梅，博士，教授，主要從事微生物發酵與土傳病害生物防治。E-mail：smwang@njau.edu.cn。

芹菜是傘形科耐寒性蔬菜，營養價值高，具有降血壓、清腸利便、利尿消腫等作用[1-2]。近年來芹菜連作普遍，土傳根腐病時常發生，嚴重影響產量[3]。芹菜根腐病致病菌主要有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、側雄腐霉菌（Pythium paroecandrum）及核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等，病原菌的孢子或菌核可在土壤中潛伏多年，常規的物理及化學手段難以有效根除，生物防控綠色、高效，近年通過生防制劑防控土傳病害的有效案例多有報道[4]。

放線菌在防控土傳病害、促進植株生長等方面發揮著重要作用。文獻報道，放線菌具有產生拮抗物質及改善根際微生物群落結構達到防控植物病害的作用[5-6]。由于微生物的遺傳不穩定性，隨著菌株傳代次數的增加，拮抗菌產生活性物質的能力會下降，經過誘變處理可獲得相對高產的菌株，單一誘變劑誘變微生物的方法很多，但突變株易發生回復突變[7]，而多種誘變劑的復合誘變具有協同、高效的作用。白刺鏈霉菌（Streptomyces albospinus）CT205是實驗室保存的一株抗菌譜廣泛、對植物真菌病害具有良好防控效果的生防菌株，其代謝產生的活性物質為環己酰亞胺[8-9]，本研究通過對菌株CT205進行物理和化學復合誘變獲得相對高效的突變株，制備生防制劑，通過田間試驗研究其對芹菜根腐病的生防效果。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株S. albospinus CT205實驗室保存。種子培養基：葡萄糖45.0 g，大豆粉30.0 g，酵母粉5.0 g，CaCO3 5.0 g，去離子水1 L，pH值 7.5;發酵培養基：蔗糖 20.0 g，可溶性淀粉 30.0 g，大豆粉 8.0 g，CaCO3 3.0 g，蛋白胨2.0 g，NaCl 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 L，pH值8.0。

1.2 高效生防菌的誘變篩選

1.2.1 菌株CT205單孢子懸液制備 白刺鏈霉菌菌株CT205劃線接種于PDA平板上，28 ℃培養，待分生孢子形成，刮取分生孢子制備孢子懸液，無菌脫脂棉過濾去除菌絲體，然后顯微計數，將孢子濃度調整為108個/mL。

1.2.2 UV+LiCl復合誘變及突變株篩選 在直徑90 mm培養皿中加入10 mL孢子懸液，磁力攪拌器放在距離紫外（UV）燈的垂直高度約30 cm處，培養皿放在磁力攪拌器上打開皿蓋，適宜轉速緩慢攪動，照射時間設置0.5、1、2、4、6 min等5個處理，照射結束暗處理30 min，孢子懸液系列稀釋后，取10-3、10-4系列稀釋液各100 μL，涂布在含有 0.1%～0.6% LiCl的PDA平板上培養，每個處理5個重復，28 ℃避光培養，設置空白處理對照。菌落長出后統計不同處理菌落致死率，選取致死率 70%～80%的處理，挑選與野生型菌落形態相似或不同的菌落[10]。先以酵母菌為指示菌通過拮抗圈檢測拮抗活性進行初篩，然后通過搖瓶液體發酵進行復篩，即菌株的分生孢子接種在種子培養基中，在28 ℃ 170 r/min的搖床中培養48 h，然后轉接到發酵培養基中于相同條件下培養96 h，發酵液 6 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用生物活性法檢測發酵上清液中活性物質的含量[11]，在此基礎上選擇傳代穩定、效價高的突變菌株制備固體制劑。

1.2.3 突變株U-L-4對芹菜根腐病病原菌的拮抗作用 芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） J01由前期實驗室分離保存，并經柯赫氏法則驗證其致病性[11]。用平板對峙法測試誘變菌株U-L-4及野生株CT205對病原菌的拮抗效果。將誘變菌株與野生株、F. oxysporum J01分別接種在PDA平板于28 ℃培養7 d。用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌塊，將病原菌菌塊放置在PDA平板中央，以菌塊為中心，在距離菌塊 20 mm 處兩側對稱接種生防菌株，并設置對照，每處理重復3次，28 ℃培養5 d，測定菌株對病原菌的抑制率。抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑）×100%。

1.2.4 突變株的固體發酵及生物有機肥制備 根據前期固體發酵條件的優化，固體發酵配方由以下比例組成，細土與沙 ∶麥麩 ∶花生餅 ∶椰糠 ∶小米 ∶肉骨粉=4 ∶2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1，料水比1 ∶0.8，混合攪拌均勻后，裝袋121 ℃ 30 min滅菌，按10%的接種量接種種子液，分裝淺盤，厚度2.0～2.5 cm，28 ℃ 培養14 d，取樣稀釋涂布測其活菌數。細土：取南京麒麟鎮后村菜園土（黃棕壤）研磨處理，細土與沙過20目篩，肉骨粉由華中農業大學資環學院李國慶教授提供。固體發酵制備的菌劑，按10%比例復合有機肥制備生物有機肥，有機肥由淮安柴米禾生物科技公司提供。

1.2.5 田間試驗 2019年9—11月，在南京溧水華城蔬菜種植合作社進行田間試驗。土壤類型為馬肝土，含全氮1.87 g/kg、速效磷172.4 mg/kg、速效鉀155.23 mg/kg、有機質26.77 g/kg，pH值7.18，土壤中尖孢鐮刀菌計數為2.3×104 CFU/g。大棚種植前施用普通有機肥1 500 kg/hm2和三元復合肥（純N、P2O5、K2O含量均為16%）、尿素（N>46%）、硫酸鉀（K2O>52%）各300 kg/hm2，作基肥，撒施深翻整平、培壟。設置U-L-4生物有機肥（108 CFU/g）、木霉生物有機肥（淮安柴米禾生物科技公司提供，木霉有效活菌數108 CFU/g）和對照3個處理，大棚等面積分9塊，每個處理3個重復，小區面積2×2 m2。U-L-4生物有機肥處理減施10%三元復合肥。

移栽35 d的芹菜苗，株距20 cm，生物有機肥處理每株穴施10 g。移栽種植后35 d，統計不同處理芹菜發病情況，取不同處理1×1 m2芹菜植株連根拔起，統計生物量，計算產量。取芹菜根際土，稀釋涂布法測定土壤中細菌、放線菌、真菌以及尖孢鐮刀菌的數量。尖孢鐮刀菌用Komada選擇性培養基（K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.5 g，Fe-EDTA 0.01 g，天門冬酰胺 2.0 g，D-半乳糖20.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 L，pH 值7.2～7.4）計數。

1.2.6 數據處理與統計 本研究數據利用Microsoft Office Excel 2010、SPSS BASE ver.25.0統計分析，在α=0.05水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 高效誘變菌株的篩選

由圖1可見，隨著UV處理時間的延長，致死率不斷增加，1～2 min致死率急劇上升，4～6 min致死率處于90%左右，6 min時致死率接近100%。

參考UV誘變處理的致死率結果，選擇0.5、1、2 min 等3個UV照射劑量，進行UV-LiCl復合誘變處理，結果（表1）發現，經紫外照射0.5 min后，致死率伴隨LiCl濃度的增加而出現下降的趨勢，而1 min與2 min UV照射與0.1%～0.6%的LiCl誘變結合致死率無明顯規律。根據致死率，選擇在0.5 min UV和0.1% LiCl處理中挑選菌落。

共挑取105個菌落，通過與酵母菌拮抗試驗對比得到20株正突變菌。5次傳代培養后，發現有12株菌株拮抗能力下降。剩余8株菌株依次編號 U-L-1、U-L-2、U-L-3、…、U-L-8，分別測定2次液體發酵上清液中環己酰亞胺的含量，結果發現誘變株U-L-2與U-L-4的產量較高，達到42 mg/L左右，但傳代后菌株U-L-2生長緩慢、分生孢子不豐富，最終選擇U-L-4進行后續試驗，其活性物質產量較野生菌株提高了55.56%（圖2）。

2.2 突變株U-L-4對病原菌抑制效果

對峙試驗結果表明，突變株U-L-4與野生型CT205均對芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌表現出良好的抑菌效果（圖3），與野生型CT205相比，誘變菌株的抑菌能力顯著提高，對病原菌的抑菌率達到70.31%（表2），因此后續利用誘變菌株U-L-4進行固體發酵及對芹菜根腐病進行防控。

2.3 突變菌株U-L-4固體發酵及生物有機肥制備

菌株U-L-4種子液按10%接種量接種后 3 d，菌體在培養基上生長旺盛，基質表面出現白色菌絲體。接種后7 d，基質表面的白色變為灰色（圖4），基質散發放線菌特有的“土腥味”，鏡檢發現大量菌絲及少量分生孢子。培養14 d，取樣鏡檢發現大量分生孢子，然后活菌計數，U-L-4固體制劑活菌數達8.0×108 CFU/g。按10%比例復合有機肥制備生物有機肥。

2.4 田間試驗結果

2.4.1 不同處理芹菜生物量及產量的差異 結果表明，施用U-L-4生物有機肥及木霉生物有機肥與對照相比，芹菜的株高、鮮質量等生物量顯著增加（圖5、表3）。對照處理的芹菜發病率為27.91%，經觀察發病植株根基部出現一定程度的腐爛且有褐黃色水漬。木霉生物有機肥處理的芹菜發病率為6.67%，發病芹菜根基部出現斷口，無明顯水漬。U-L-4生物有機肥處理植株沒有出現發病植株。經統計U-L-4生物有機肥處理和木霉生物有機肥處理的芹菜產量分別達到20 979、15 984 kg/hm2，分別比對照提高了75.00%、33.33%。

2.4.2 不同處理芹菜植株根際主要微生物數量變化 施用U-L-4生物有機肥及木霉生物有機肥處理芹菜根際主要微生物數量發生顯著變化（表4）。U-L-4生物有機肥處理后，根際土中細菌數量較木霉及對照處理顯著降低，放線菌數量較木霉及對照處理顯著增加。U-L-4生物有機肥與木霉生物有機肥處理根際土壤中真菌的數量變化差異不顯著，但與對照相比顯著降低。比較各處理根際土壤中尖孢鐮刀菌的數量變化，發現U-L-4生物有機肥及木霉生物有機肥均能顯著降低尖孢鐮刀菌的數量，但U-L-4生物有機肥處理的效果更好，尖孢鐮刀菌的數量降低一個數量級，顯著改善了芹菜根際微生物群落組成。

3 討論與結論

微生物野生菌株效價低是常見問題，妨礙了功能微生物在實際生產中的應用[12]。誘變選育是篩選高效菌株的重要途徑，常規誘變方法包括物理誘變、化學誘變、生物誘變、復合誘變等[13]，其中復合誘變是使用2種以上或多次使用1種誘變劑的重要誘變手段，通常誘變劑之間具有協同作用。如 UV-LiCl 復合誘變， LiCl本身沒有誘變作用， 但通過協同作用可以提高UV的誘變效果從而可獲得更為高效的誘變菌株。李蕤等對木霉T6采用UV-LiCl復合誘變后獲得一株產幾丁質酶和葡聚糖酶能力顯著提升的突變菌株[14]。在對微生物誘變選育時要在合適誘變致死率的處理中挑選誘變菌株進行研究，研究發現在70%～80%的誘變致死率中更易出現正突變菌株[15]。本研究采用UV-LiCl復合誘變在70%～80%的誘變致死率中篩選獲得1株正突變菌株U-L-4，其抑菌活性物質產量較野生型提高了55.56%。

芹菜根腐病病原真菌可以在土壤中存活多年，土傳病害一旦發生，難以有效防治[16]。土地熏蒸是一種化學防控措施，使用棉隆消毒劑對土地熏蒸有一定效果，但是在棉隆熏蒸消毒后，土壤中各類微生物數量急劇下降，對微生物群落結構造成嚴重破壞[17]。土傳病害的生物防控是促進農業可持續發展的重要措施，開發使用生防制劑取代化學藥劑成為當前土傳病害的重要防控手段[18-19]。生防菌株可以通過影響植物根際微生物群落結構防控病害的發生[20]。楊可欣等研究發現，大豆接種芽孢桿菌 8-32 生物制劑處理后，土壤酶活增加，根際微生態發生變化，尖孢鐮刀菌數量顯著降低，大豆根腐病防控效果顯著[21]。王寧等通過高通量測序發現，在施用木霉生物制劑制劑后，草莓根際真菌多樣性降低，細菌多樣性無明顯變化，有害真菌數量減少，防控草莓土傳病害效果達到65%[22]。何斐等報道，魔芋接種放線菌制劑處理后，土傳病害防控效果顯著，根際微生物區系發生顯著變化，放線菌數量增加，有害真菌和細菌數量下降，魔芋根際微生物從“真菌型”和“細菌型”變為“放線菌型”[23]。本研究結果與之相似。目前功能微生物的篩選及生物有機肥的研發方興未艾，新型生物有機肥的應用，有利于改良土壤，保護生態環境，提高農業種植水平和農作物產品品質。

本研究利用UV-LiCl復合誘變得到一株優良的突變菌株U-L-4。利用其制備的生物有機肥可有效防控芹菜根腐病，促進芹菜生長，提高芹菜產量，并顯著降低根際土壤中病原真菌-尖孢鐮刀菌的數量，改善了根際生態環境，芹菜增產75%。

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