不同蛋白水平飼料對大規格松浦鏡鯉越冬后體質量損失、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達的影響

范澤 吳迪 李晨輝 張圓圓 李晉南 王連生

摘要：研究不同飼料蛋白水平（24%、26%、28%、30%、32%、34%）對大規格松浦鏡鯉越冬前后生長、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達的影響，前期進行完大規格松浦鏡鯉對飼料蛋白質適宜需要量的研究試驗后，在每個網箱中保留規格齊整，質量為（694.55±64.72） g的20尾大規格鯉魚進行越冬試驗，共18個網箱（2.0 m×2.0 m×2.0 m），時間為2019年10月31日至2020年4月28日。越冬期間水溫3～8 ℃。結果表明，26%蛋白組的體質量損失率及肥滿度下降比顯著低于24%、32%、34%蛋白組（P<0.05），24%蛋白組的肝體比下降比顯著高于其他各組（P<0.05）。各組間存活率無顯著差異（P>0.05）。26%蛋白組越冬后肌肉粗蛋白含量顯著高于24%蛋白組，且其下降比顯著低于24%蛋白組（P<0.05）。24%組和32%組的肌肉水分含量顯著高于26%組（P<0.05），32%組肌肉水分增加比顯著高于26%和34%組（P<0.05）。26%蛋白組鯉魚肝胰臟的過氧化氫酶和過氧化物酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），超氧化物歧化酶活性顯著高于30%蛋白組（P<0.05），谷胱甘肽含量顯著高于24%蛋白組（P<0.05）。34%蛋白組的丙二醛含量顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉雷帕霉素受體基因表達量顯著高于24%、34%蛋白組（P<0.05）。26%蛋白組的肌肉4E結合蛋白1基因表達量顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的肌肉S6K蛋白激酶及蛋白激酶B基因表達量顯著高于除24%蛋白組外的其他各組（P<0.05）。越冬試驗發現，26%蛋白組鯉魚越冬效果最佳，體質量損失率及肥滿度下降比均為最低，魚體能夠儲存更多的蛋白質，使機體獲得較強的抗氧化能力和較低的氧化應激水平，擁有較強的自身內源蛋白質合成能力。

關鍵詞：越冬;飼料蛋白;松浦鏡鯉;體質量損失率;抗氧化;蛋白質合成

中圖分類號：S963.1;S965.116? ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0174-07

收稿日期：2021-04-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：31802305）;中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（編號：HSY202111Q）;國家現代農業產業技術資助項目。

作者簡介：范 澤（1992—），男，內蒙古扎蘭屯人，碩士，研究實習員，主要從事水產動物營養與飼料研究。 E-mail：dankey1534417945@163.com。

通信作者：王連生，博士，副研究員，長期從事水產動物營養與飼料研究。E-mail：wangliansheng@hrfri.ac.cn。

鯉魚作為池塘養殖的主要品種，2017—2019年其產量穩居國內第4名，已成為我國主導水產淡水養殖品種之一[1]。作為我國鯉魚主養區，“三北”（東北、華北、西北）地區的鯉魚年產量約占池塘養殖總量的50%～60%。這些地區與其他鯉魚養殖地區最主要的差異在于冬季更為漫長寒冷。因此，在這些地區越冬成為鯉魚養殖非常重要的一個階段，當年魚種的越冬體質量損失勢必會降低越冬成活率和影響魚體生理生化狀態的恢復，進而影響翌年魚種的生長和品質，致使養殖收益降低。深入研究越冬對鯉魚生理生化狀態的影響是推動鯉魚健康養殖的基礎且也是必要的工作。目前，有關越冬影響鯉魚生理機能變化已有相關研究[2]。除此之外，越冬前投喂飼料的質量及營養水平也影響著魚體在越冬過程中的生理生化水平，但有關飼料營養對鯉魚越冬的影響鮮有報道。

蛋白質作為漁用飼料中最重要的營養成分，不僅決定著各組織器官的生長和修復，也是組成酶、激素和抗體等生物活性物質的主要成分[3]。飼料中適宜的蛋白水平能夠促進魚類的生長和維持機體正常代謝，但過低或過高的蛋白水平均會影響機體的正常生長發育[4-6]。目前，從研究指標來看，飼料蛋白水平對鯉魚影響的研究主要集中于生長性能、體成分[7]、消化酶活性、抗氧化能力[8]等方面，缺乏針對越冬的試驗研究。

松浦鏡鯉于2008年通過全國水產原種和良種審定委員會審定，在10多年的推廣過程中，養殖規模和分布地域逐年擴大，取得了良好的經濟效益和社會效益，已成為我國鯉魚主要的養殖品種[9]。筆者所在課題組在先前的研究中發現大規格松浦鏡鯉（246.00±17.36） g對飼料蛋白質最適需求量分別為26%[10]。本試驗在前期研究基礎上探討飼料蛋白水平對大規格松浦鏡鯉越冬前后生長、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達的影響，研究飼料蛋白水平與鯉魚越冬的關系，為鯉魚在北方越冬期及越冬后的健康養殖提供科學依據和基礎，為開發有利于鯉魚越冬的飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、豆粕為蛋白質源，豆油為脂肪源，通過設置不同水平的豆粕及次粉配制24%、26%、28%、30%、32%、34%等6組蛋白水平的試驗飼料，其組成及營養水平見表1。飼料制作在哈爾濱市合禾飼料有限責任公司完成，首先將所有干性原料經粉碎機后，過60目篩，按逐級放大原則使用混勻機攪拌混勻，后依據飼料配方比例加入豆油，在混勻機中充分混合后使用飼料制粒機制成直徑為3.00 mm的沉性顆粒飼料。

1.2 試驗魚及飼養管理

在進行完大規格松浦鏡鯉對飼料蛋白質適宜需要量的研究試驗后（2019年10月底），在每個網箱中保留規格齊整，質量為（694.46±64.72） g的20尾大規格鯉魚進行越冬試驗，共18個網箱（2.0 m×2.0 m×2.0 m），越冬期間不投喂任何食物，只進行水溫檢測。越冬試驗時間為2019年10月31日至2020年4月28日。越冬期間水溫3～8 ℃。

1.3 樣本采集

越冬周期結束后對試驗魚進行計數并對所有試驗魚進行稱質量，以計算存活率及增質量率;從每箱中隨機取3尾魚，對其體長進行測量，以計算肥滿度;試驗魚于冰盤中迅速解剖取其肝胰臟及肌肉，樣本轉入-20 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 生長指標計算 養殖試驗增質量率=（養殖試驗平均終末體質量-養殖試驗平均初始體質量）×100%/（養殖試驗平均初始體質量）;養殖試驗肥滿度（g/cm3）=（養殖試驗平均終末體質量）/（養殖試驗平均終末魚體長）3;養殖試驗肝體比=（養殖試驗結束時肝胰臟質量）×100%/（養殖試驗平均終末體質量）;越冬后體質量損失率=（養殖試驗平均終末體質量-越冬后平均體質量）×100%/（養殖殖試驗平均終末體質量）;越冬后肥滿度（g/cm3）=（越冬后平均體質量）/（越冬后平均終末魚體長）3;肥滿度下降比=（養殖試驗肥滿度-越冬后肥滿度）×100%/（養殖試驗肥滿度）;越冬后肝體比=（越冬后肝胰臟質量）×100%/越冬后平均終末體質量;肝體比下降比=（養殖試驗肝體比-越冬后肝體比）×100%/養殖試驗肝體比;

肌肉粗蛋白下降比=（越冬前粗蛋白含量-越冬后粗蛋白含量）×100%/越冬前粗蛋白含量;肌肉粗脂肪增加比=（越冬后粗脂肪含量-越冬前粗脂肪含量）×100%/越冬前粗脂肪含量;肌肉水分增加比=（越冬后水分含量-越冬前水分含量）×100%/越冬前水分含量;越冬存活率=（越冬后試驗魚尾數）×100%/（越冬前試驗魚尾數）。

1.4.2 肌肉成分的測定 粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 6433—1994飼料粗脂肪測定方法）進行測定，水分及灰分分別采用常壓恒溫烘干法（GB 6435—1986飼養水分的測定方法）測定，550 ℃ 灼燒法 （GB/T 6438—2007飼料中粗灰分的測定）進行測定。

1.4.3 肝胰臟抗氧化酶活性的測定 粗酶液的制備：肝胰臟在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，用移液管加入9倍于組織塊質量的預冷勻漿介質（0.85%生理鹽水），使用電動勻漿器進行勻漿，4 ℃ 4 500 r/min離心15 min，取上清液于 -80 ℃ 冰箱備用。肝胰臟中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性和谷胱甘肽、丙二醛含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定（貨號分別是：A001-3、A007-1-1、A084-1-1、A006-2-1、A003-1）。

1.5 蛋白質代謝相關基因的相對表達量測定

越冬周期結束后每個網箱隨機取3尾魚，取其肝胰臟于液氮中研磨。利用Trizol法提取各組織總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（Code No：RR047A）說明書，將總RNA反轉錄為cDNA。

根據GenBank中現有的鯉魚雷帕霉素靶蛋白、4E-結合蛋白1、磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B、S6K蛋白激酶及β-actin保守序列設計引物。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

實時熒光定量PCR反應根據SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Code：RR420A）試劑盒說明書進行，采用SYBR Green染色法，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System實時PCR檢測系統下進行。為了避免擴增批次間存在差異，目的基因與其對應的內參基因同時擴增，每個模板均做3個重復，得到3個CT值，取其平均值作為最終CT值，后運用比較CT法（ΔΔCT）對所得數據進行分析比較進而得到各模板中各基因的相對表達量，計算公式為：相對表達量=2-ΔΔCT=2-[（CT處理-CT內參）-（CT對照-CT內參）]。

1.6 數據統計

所有數據均用Excel 2007及SPSS 22進行分析處理。利用Excel軟件制作各指標的標準曲線，并利用標準曲線計算得出各樣品中對應指標的活性含量。所有數據均以“平均值±標準差”表示，并利用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），差異達到顯著水平（P<0.05），則進行Duncans新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白水平飼料對松浦鏡鯉越冬后魚體質量及存活率的影響

從表3可以看出，越冬前的8周養殖試驗中，26%蛋白組的平均質量為（758.50±51.83） g，顯著高于32%蛋白組（629.62±6.69） g、34%蛋白組（670.74±17.01） g（P<0.05），26%蛋白組增質量率為（197.33±8.84）%顯著高于其他各組（P<0.05）。越冬后，各蛋白水平組鯉魚體質量呈現一定比例下降，其中26%蛋白組的越冬后體質量為（709.79±45.82） g，顯著高于32%蛋白組（572.53±4.70） g，其體質量損失率為（6.37±1.02）%顯著低于24%、32%、34%蛋白組（P<0.05）。越冬存活率在各組間無顯著差異（P>0.05），以24%蛋白組為最低（94.91±2.89）%。

2.2 不同蛋白水平飼料對松浦鏡鯉越冬后形體指標的影響

從表4可以看出，各蛋白水平組的肥滿度和肝體比均表現出一定比例的下降。越冬前，各組間肥滿度無顯著差異（P>0.05），而越冬后，26%蛋白組的肥滿度為（3.57±0.12） g/cm3，顯著高于其他各組（P<0.05），其下降比為（1.64±0.49）%，顯著低于其余各組。越冬前，各組間肝體比亦無顯著差異，而越冬后，26%蛋白組為（1.54±0.15）%和28%蛋白組為（1.53±0.19）%的肝體比顯著低于其他各組（P<0.05）。24%蛋白組的肝體比下降比為（24.77%±7.63%）顯著高于其他各組（P<0.05），其他各組間無顯著差異（P>0.05）。

2.3 不同蛋白水平飼料對松浦鏡鯉越冬后肌肉營養成分的影響

從表5可以看出，各蛋白水平組越冬后肌肉粗蛋白呈現一定比例的下降，其中26%蛋白組越冬后肌肉粗蛋白含量為（15.74±0.07）%最高，顯著高于24%蛋白組（7.25±0.32）%，且其下降比為最低（7.45±1.44）%，顯著低于其余各組（P<0.05）。各蛋白水平組越冬后肌肉粗脂肪呈現一定比例的增加，28%蛋白組的越冬后肌肉粗脂肪含量為（6.15±0.73）%顯著高于24%蛋白組（5.37±0.30）%和30%蛋白組（5.15±0.16）%（P<0.05），32%蛋白組的粗脂肪增加比為（134.90±11.14）%顯著高于其他各組（P<0.05）。各蛋白水平組越冬后肌肉水分整體呈現一定比例的增加，但各組間水分增加比并無顯著差異（P<0.05），24%蛋白組的越冬后肌肉水分含量為（79.00±0.31）%顯著高于28%蛋白組（77.54±0.49）%（P<0.05），32%組肌肉水分增加比顯著高于26%和34%組（P<0.05）。

2.4 不同蛋白水平飼料對松浦鏡鯉越冬后肝胰臟抗氧化酶活性的影響

從表6可以看出，越冬后26%蛋白組鯉魚的過氧化氫酶和過氧化物酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），超氧化物歧化酶活性顯著高于30%蛋白組（P<0.05），谷胱甘肽含量顯著高于24%蛋白組（P<0.05）。越冬后34%蛋白組的丙二醛含量顯著高于其他各組（P<0.05）。

2.5 不同蛋白水平飼料對松浦鏡鯉越冬后蛋白合成相關基因表達的影響

從表7可以看出，26%蛋白組的越冬后肌肉雷帕霉素靶蛋白基因相對表達量與28%蛋白組并列最高，顯著高于24%、34%蛋白組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉4E-結合蛋白1基因相對表達量最高，顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉蛋白激酶B基因相對表達量最高，顯著高于除24%蛋白組以外的其他各組（P<0.05）。

3 討論與結論

松浦鏡鯉是在德國鏡鯉選育系基礎上進一步培育出的，無論在鱗被、生長，還是在抗逆、抗病方面較德國鏡鯉具有較為顯著的優勢[11]。于淼從形態學、組織學及生化組成等3個方面綜合分析了越冬對松浦鏡鯉生存、生長的影響[12]。本試驗從越冬前飼料蛋白供給水平入手研究飼料營養對鯉魚越冬的潛在影響。

實際應用領域中體質量、肥滿度、肝體比常作為評估魚體生理生化或營養狀況的重要參數。在本試驗中，越冬后各蛋白組的體質量損失率在6.37%～9.49%，其中以26%蛋白組的體質量損失率為最低;各蛋白組的肥滿度下降比在5.89%～23.61%，其中以26%蛋白組為最低，而于淼發現越冬后松浦鏡鯉（248.87 ±15.75） g的體質量損失率達10.8%，肥滿度降低比達23.26%[12]。而這種差異可能主要源于2個方面：（1）一般而言，魚規格大且肥滿度高，則越冬效果好[13]。在本研究中松浦鏡鯉越冬前體質量均為（694.55±64.72） g，而后者的松浦鏡鯉越冬前體質量均為（248.87±15.75） g，規格差異影響了二者的越冬效果;（2）除規格外，越冬前飼料營養供給會影響魚類的越冬效果。Charo-Karisa等發現，40%蛋白水平的飼料相較于天然餌料能夠顯著提升尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的耐寒性[14]。本試驗發現，當越冬前飼料蛋白水平在26%時，松浦鏡鯉的體質量損失率為（6.37±1.02）%，相較于于淼的研究結果[12]，體質量損失率大約降低3.5%，而當飼料蛋白水平低于26%或高于30%時，體質量損失率則會顯著上升，表明越冬前適宜飼料蛋白供給能夠促進魚類平穩越冬，飼料蛋白供給過多或過少均會影響魚類越冬效果。在形態學指標中，肝體比可直接反映魚類營養狀態。越冬期間由于低溫和饑餓的雙重限制，魚體分解肝臟內的能源物供能，降低肝質量，肝體比也隨之降低[15-16]，本試驗結果同樣印證了上述觀點。但需要指出的是本試驗發現不同蛋白組間肝體比下降比存在較大差異，其中以24%蛋白組的下降比顯著高于其他各組，這可能與越冬前飼料蛋白供給過少影響鯉魚魚體營養物質儲備有關，越冬期間需要大量消耗肝胰臟的儲能物質，以維持機體正常的生理機能。

魚的種類及食性、溫度、越冬前營養狀態、饑餓程度的差異均與越冬時魚類營養物質利用的順序先后和數量多少密切相關。于淼研究發現，在冰下階段（170～325 d）肌肉蛋白質開始消耗，整個越冬期肌肉蛋白質含量下降比為5.35%，越冬后肌肉脂肪含量與體質量損失率呈顯著負相關，說明越冬后肌肉蛋白水平能體現越冬期體質量損失程度[12]。本研究主要考察了飼料蛋白水平對整個越冬期肌肉營養物質的影響情況，初步探討飼料外源營養如何影響松浦鏡鯉內源營養在越冬期間的利用。經歷整個越冬期，各蛋白組的肌肉粗蛋白含量均減少，下降比在8.97%～24.38%之間，以26%蛋白組的下降比為最低，24%蛋白組的下降比為最高，與于淼的研究結果[12]相比，本試驗中各蛋白組松浦鏡鯉的肌肉粗蛋白含量下降比均處于高位，表明規格差異可能是影響越冬過程中機體營養物質利用的關鍵因素。同時表明越冬前飼料蛋白供給過少會影響魚體肌肉蛋白質的沉積及能量物質的儲備，使得過多的蛋白質用于維持機體的正常能量供應，這一點也被越冬后肌肉脂肪含量的變化情況所證實。本試驗發現，越冬后各蛋白組松浦鏡鯉肌肉脂肪含量相較于越冬前顯著提升，主要原因可能是越冬期間機體脂肪持續供能，致使越冬后期脂肪含量已處于較低水平，造成供能不足，因此機體動用蛋白質氧化分解供能，并轉化為脂肪和糖類。蛋白質氧化分解的程度可能是影響松浦鏡鯉越冬后代謝機能恢復的主要因素，但其具體作用機制需要進一步研究。此外，越冬期間各試驗組松浦鏡鯉肌肉水分含量明顯增加，原因可能是體液將蛋白質和脂肪分解代謝后留出的空間充滿，增加了肌肉水分含量[16]。這與其他魚類饑餓狀態下肌肉水分含量變化情況相似[17]。

越冬期間，魚類需克服來自低溫冷應激和食物匱乏的雙重壓力。相關研究表明，急性和慢性冷應激、長期饑餓都會引起魚類組織中的氧化應激[18-20]。鯉魚在長期冷應激后，肝臟和白肌中的抗氧化酶基因的表達也出現顯著升高[21]。因此，氧化損傷和抗氧化能力能夠反映越冬后魚類的健康狀況[22]。武文一研究發現，越冬前強化飼料中含有31.53%蛋白和4%脂肪，降低了越冬期間草魚初始體質量（27.55±1.57） g產生的氧化應激，提升了魚體的抗氧化能力，保證了草魚的安全越冬[23]。本試驗結果表明，無論是在抗氧化酶活性方面，還是氧化產物丙二醛含量方面，26%蛋白組均表現最優，使機體獲得了較強的抗氧化能力和較低的氧化應激水平。因此，明確養殖魚類越冬前最佳飼料蛋白質供給水平有助于魚類在越冬期間擁有更強的抗氧化能力和免疫能力，有利于魚類安全越冬。

低溫冷應激影響蛋白質的分解和合成代謝[24]。魚類生長是機體合成代謝不斷積累的結果，低溫冷應激除了通過限制魚體攝食和消化吸收功能，減少合成代謝所需的營養原料而降低魚類的生長速度外[25]，還會通過影響機體蛋白質合成通路相關基因的表達，制約機體的蛋白合成能力[26]。雷帕霉素受體信號通路是影響魚類蛋白質合成的主要信號通路，活化后的雷帕霉素靶蛋白可以調節2條平行的信號通路：4E-結合蛋白通路和S6激酶通路。雷帕霉素受體復合物直接磷酸化4E-結合蛋白和S6K蛋白激酶，從而促進蛋白合成[27-28]。魯棟梁研究發現，在低溫條件下饑餓3 d顯著降低了斑馬魚雷帕霉素靶蛋白和S6K蛋白激酶蛋白的磷酸化水平及基因表達水平[26]，揭示雷帕霉素受體信號通路對斑馬魚冷應激耐受機制有一定的調控作用，同時抑制雷帕霉素受體信號通路可能是饑餓激活各種冷應激耐受機制的調控途徑。在筆者所在課題組前期的研究中發現，26%蛋白水平能夠顯著提升松浦鏡鯉肌肉蛋白合成相關基因的表達[10]。在越冬后，無論是哺乳動物雷帕霉素靶棟（mTOR）信號通路上游的磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B基因表達量，還是雷帕霉素靶蛋白基因表達量，以及下游的4E-結合蛋白和S6K蛋白激酶基因表達量，同樣均以26%蛋白組為最高，表明越冬前適宜的飼料蛋白供給能夠顯著增強機體蛋白合成能力，有助于機體在越冬期間自身內源蛋白質的合成，這與肌肉粗蛋白含量結果相吻合。此外，與魯棟梁的短期低溫冷應激試驗[26]不同，首先越冬前期機體脂肪和糖原為主要功能原料，后期肌肉蛋白質參與供能[12]，內源蛋白質消耗促進機體內源蛋白質合成，因此雷帕霉素受體信號通路被激活，相關蛋白和基因表達量上升;其次，越冬后期水溫逐漸上升，鯉魚能夠通過攝取底泥中殘留的營養物質，逐步滿足蛋白質合成所需的營養原料[12]，進而激活雷帕霉素受體信號通路。但飼料蛋白質調控越冬期松浦鏡鯉的肌肉蛋白質合成的機體作用機制仍需進一步研究。

越冬前飼料蛋白水平為26%對大規格松浦鏡鯉安全越冬作用最為明顯，效果最佳。在整個越冬期，26%蛋白組能夠使體質量損失率及肥滿度降低比最小化，使魚體能夠儲存更多的蛋白質，并獲得較強的抗氧化能力和較低的氧化應激水平，擁有較強的自身內源蛋白質合成能力。

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