谷子SBP 轉錄因子家族基因的表達分析

杜曉芬，韓康妮，李禹欣，王智蘭，連世超，王 軍

（山西農業大學谷子研究所，雜糧種質創新與分子育種山西省重點實驗室，雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西長治 046011）

SBP（Squamosa promoter binding protein）轉錄因子是植物中一類重要的轉錄因子，又被命名為SPL（Squamosa promoter binding protein like），最早從金魚草中鑒定出來，因其能夠特異識別和結合花分生組織特征基因SQUAMOSA（SQUA）的啟動子區而得名[1]。該基因家族由多個成員組成，盡管SBP 轉錄因子家族成員在蛋白質一級結構上存在較大差異，但是均含有一個由79 個氨基酸殘基組成的高度保守的DNA 結構域，稱為SBP 結構域，該結構域包含2 個典型的由半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基組成的鋅指基序結構（Cys-Cys-His-Cys 和Cys-Cys-Cys-His）[2]，在結構域的C 端具有保守的核定位信號，能夠引導SBP 蛋白進入細胞核行使其功能[3]。

目前，SBP 轉錄因子家族基因已經在擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[6]、玉米[7-8]、棉花[9-10]、高粱[11]、油菜[12]、大豆[13]、蕎麥[14]、桑樹[15]和小麥[16]等多種植物中進行了鑒定和分析。其中禾本科作物中，高粱鑒定的數量最少（18 個），小麥數量最多（56 個）。研究表明，SBP轉錄因子家族基因參與植物形態建成。擬南芥中，AtSPL3 促進開花，同時調控花和花序發育[17]，AtSPL9和AtSPL10 能夠降低葉片生產速率，導致葉片數量減少，葉面積增大[18]，AtSPL3、AtSPL4 和AtSPL5 促進葉片遠軸面表皮毛的形成[19]；水稻中，OsSPL14 是控制水稻株型的關鍵基因，調控水稻的分蘗、花序分枝、穗粒數以及千粒質量[20-21]，OsSPL13 正調控谷殼中的細胞大小，從而提高水稻的粒長和產量[22]，OsSPL3/OsSPL12 調控水稻不定根的發生[23]；玉米中，SBP 轉錄因子tga1（teosinte glume architecture）是玉米進化過程中的一個關鍵基因，對籽粒外面硬殼的生長發育具有調控作用[24]，LG1（liguleless1）與葉舌和葉耳的發育密切相關[25]，ZmSPL10/14/26 在葉片表皮毛和氣孔的發育中發揮關鍵作用[26]。另外，SBP 轉錄因子家族基因在激素信號轉導和逆境脅迫應答中也發揮重要作用。AtSPL8 參與GA 信號轉導，調控花藥發育、種子萌發和根系伸長[27]，AtSPL7 在維持銅穩態方面發揮重要作用[28]，OsSPL10 參與水稻幼苗耐鹽性的調控[29]。

microRNA（miRNA）是一類在動植物中廣泛分布的長度在20～24 nt 的非編碼小RNA，通過對靶基因進行降解或者抑制翻譯，進而降低靶基因的表達[30]?，F有研究結果表明，一些SBP 基因是miR156 和miR529 的靶基因[5，31]，擬南芥通過miR156/miR529-SPLs 模塊調控開花[32-33]，水稻通過miR156/miR529-SPLs 模塊調控分蘗、株高、穗型和籽粒發育等[34-36]。

谷子（Setaria italica）起源于我國，具有抗旱耐瘠、營養均衡、糧飼兼用、C4 高光效等特點，是旱作生態農業綠色發展的主栽作物[37]，谷子的抗旱、耐逆及高光效特性不斷引起科學家和育種家的關注，已經成為功能基因組研究的模式作物之一[38]。SBP轉錄因子家族基因具有植物生長發育和逆境脅迫響應相關元件[7，10]，谷子中目前鑒定出19 個SBP基因[39]，但是并沒有對表達模式進行深入研究。目前，SBP 轉錄因子家族基因在谷子組織器官以及響應激素和脅迫處理后的表達模式還沒有見詳細報道。

本研究擬通過分析谷子SBP 轉錄因子家族基因在不同組織器官中以及在激素和脅迫處理后的表達模式，探究該家族基因對植物激素和逆境脅迫的響應模式，為全面解析谷子SBP 轉錄因子家族基因的生物學功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的谷子品種是長農35 號，由山西農業大學谷子研究所提供。

1.2 試驗方法

將長農35 號種植于山西農業大學谷子研究所試驗田，種植6 行，行長4.5 m，行間距33 cm，于苗期（三葉一心）采集新出葉片、于孕穗期采集長度1.5、2.5、10.0 cm 的幼穗（記為幼穗1、幼穗2、幼穗3）和倒二莖、于抽穗期采集根和旗葉，上述樣品經液氮速凍后，立即放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于谷子SBP 轉錄因子家族基因的組織器官表達分析。選擇飽滿的種子播于營養缽（營養土∶蛭石＝1∶1（V/V）），放置于光照培養箱（RTOP-268Y）中，生長條件為光照16 h、溫度30 ℃，黑暗8 h、溫度25 ℃。生長至兩葉一心時進行生長素（IAA，5 μmol/L）、赤霉素（GA3，100μmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100μmol/L）、脫落酸（ABA，100 μmol/L）、干旱（20%PEG）和冷脅迫（4 ℃）處理，每處理3 次重復，分別采集對照植株和處理后1、3、6、12 h 的植株葉片，液氮速凍后，放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于谷子SBP 轉錄因子家族基因在不同激素和逆境脅迫處理的表達分析。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成

總RNA 提取參照RNAisoPlus（9108，TAKARA）說明書進行，提取檢測合格的RNA 采用PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit（6210A，TAKARA）合成cDNA，反應體系和程序參考試劑盒說明書。

1.4 熒光實時定量（Real-time PCR）分析

1.4.1 引物設計 根據宋健等[39]報道的谷子中19 個SBP 轉錄因子家族基因的ID 號，從Phytozome 數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）分別下載CDS 序列，利用Primer 5.0 軟件設計實時定量引物（表1）。

表1 實時定量PCR 的引物信息

1.4.2 反應體系及程序 熒光實時定量通過CFX96 Real-time PCR 儀（Bio-Rad）采集數據，擴增體系為：cDNA 模板1.0 μL，TB Green Premix Ex TapⅡ（RR820A，北京寶生物技術有限公司）5.0 μL，上下游引物（4 μmol/L）1.0 μL，補充ddH2O 至10 μL。擴增程序為：預變性95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環；終延伸72 ℃10 min。依據C＝2-ΔCt（ΔCt＝Ct目的基因－Ct內參基因）計算基因的相對表達量。采用SPSS 19 軟件中單因素方差分析方法進行相對表達量顯著性差異檢測。

1.5 利用轉錄組數據對SBP 轉錄因子家族基因進行表達分析

根據宋健等[39]報道的谷子中19 個SiSBPs 的ID 號，從Phytozome 數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）逐一下載對應的氨基酸序列，從MDSi 數據庫（http://foxtail-millet.biocloud.net/home）搜索其對應的基因號，然后搜索其在晉谷21 號中不同組織器官中的FPKM（Fragments per kilobase million）值，利用TBtools 軟件[40]將表達數據可視化，獲得19 個SiSBPs 在晉谷21 號不同組織器官中的表達熱圖。

1.6 啟動子順式作用元件分析

通過Phytozome 數據庫分別下載19 個SiSBPs基因1500bp 啟動子區序列（起始密碼子ATG上游），利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/we btools/plantcare/html/）分析基因的順式作用元件。

1.7 谷子SBP 轉錄因子家族基因中miR156 和miR529 靶基因預測

利 用psRNATarget server（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3）[41]搜索谷子19 個SiSBPs 基因全長cDNA 序列中的miR156 和miR529 靶基因位點，miR156a-miR156k 和miR529a-miR529b序列參考文獻[42]，所有參數為默認參數。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據庫中谷子SBP 轉錄因子家族基因在不同組織器官中的表達分析

為探究SBP 轉錄因子家族基因在谷子中的表達模式，利用MDSi 數據庫中晉谷21 號的19 個組織器官的轉錄組數據，對SBP 轉錄因子家族基因的表達模式進行了分析，結果表明（圖1），SiSBP1、SiSBP8、SiSBP10、SiSBP13、SiSBP14、SiSBP16 和SiSBP17 整體表達水平較低；SiSBP9、SiSBP14 和SiSBP19 表現為組成型表達，其中，SiSBP19 表達量相對較高，SiSBP14 表達量相對較低；另外，一些基因的表達具有組織特異性或發育時期特異性，例如SiSBP16 在灌漿期的根（T10）中特異表達，SiSBP10在萌發3 d 的種子（T1）和兩葉一心期植株（T2）中特異表達，SiSBP6 和SiSBP15 在灌漿期穗下節、旗葉、旗葉葉鞘和莖（T4～T7）中相對高表達，SiSBP18在孕穗期小穗（T11～T12）和灌漿期種子（T13～T17）相對高表達。

2.2 谷子SBP 轉錄因子家族基因的組織器官表達分析

為進一步了解谷子SBP 轉錄因子家族基因的表達模式，本研究采用實時定量PCR 對19 個SiSBPs在長農35 號不同組織器官（幼葉、旗葉、莖、根、幼穗1.5 cm、幼穗2.5 cm 和幼穗10.0 cm）的表達模式進行了分析。結果表明（圖2），SiSBP11、SiSBP17 和SiSBP18 的總體表達水平低于其他基因；SiSBP2、SiSBP18 和SiSBP19 表現為組成型表達。SiSBP2、SiSBP12、SiSBP18 和SiSBP19 在幼葉中相對高表達；SiSBP9、SiSBP13 和SiSBP15 在旗葉中相對高表達；SiSBP11 在莖中相對高表達；SiSBP1、SiSBP3、SiSBP4、SiSBP5、SiSBP6、SiSBP7、SiSBP8、SiSBP10、SiSBP14、SiSBP16 和SiSBP17 在幼穗中相對高表達。

2.3 谷子SBP 轉錄因子家族基因的順式作用元件分析

為更好地了解谷子SBP 轉錄因子家族基因在逆境脅迫響應過程中的作用，本研究對19 個SiSBPs起始密碼子上游1 500 bp 啟動子區進行順式作用元件分析（表2），除轉錄和光響應等必需順式作用元件外，大部分SiSBPs 還存在激素和逆境脅迫響應等順式作用元件。其中，除SiSBP5、SiSBP11、SiSBP12外，其余16 個SiSBPs 啟動子區都含有脫落酸響應元件（ABRE）；除SiSBP1、SiSBP6、SiSBP10、SiSBP13、SiSBP16、SiSBP18 外，其余13 個SiSBPs 啟動子區都含有茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACGmotif）；生長素響應元件（AuxRR-core 和TGA-element）分布于SiSBP1、SiSBP2、SiSBP3、SiSBP4、SiSBP5、SiSBP13、SiSBP16、SiSBP19 的啟動子區；赤霉素響應元件（GARE-motif 和P-box）分布于SiSBP2、SiSBP3、SiSBP5、SiSBP7、SiSBP10、SiSBP11、SiSBP12、SiSBP13、SiSBP14、SiSBP19 的啟動子區；低溫響應元件（LTR）分布于SiSBP1、SiSBP3、SiSBP8、SiSBP9、SiSBP10、SiSBP13、SiSBP17、SiSBP18 和SiSBP19 的 啟 動 子區；干旱響應元件（MBS）分布于SiSBP2、SiSBP3、SiSBP6、SiSBP7、SiSBP10、SiSBP11、SiSBP12、SiSBP16、SiSBP19 的啟動子區；胚乳表達相關元件（GCN4_motif）分布于SiSBP6、SiSBP10 和SiSBP12 的啟動子區；水楊酸響應元件（TCA-element）分布于SiSBP4、SiSBP9 和SiSBP11 的啟動子區；生物鐘相關響應元件（circadian）分布于SiSBP9 和SiSBP12 的啟動子區；種子特異調控響應元件（RY-element）分布于SiSBP1 和SiSBP17 的啟動子區；根特異響應元件（motif I）位于SiSBP17 的啟動子區。

表2 谷子SBP 轉錄因子家族基因啟動子區的順式作用元件

2.4 谷子SBP 轉錄因子家族基因在激素和脅迫條件下的表達分析

順式作用元件分析表明，19 個SiSBPs 啟動子區均存在激素和逆境脅迫等相關順式作用元件。為進一步研究谷子SBP 轉錄因子家族基因在激素和逆境脅迫響應過程中的作用，本研究在谷子苗期分別進行生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、干旱和冷處理，利用熒光實時定量方法檢測谷子SBP 轉錄因子家族基因對激素和逆境的響應情況。綜合19 個SiSBPs 在晉谷21 號中兩葉一心期植株（T2）和長農35 號中幼葉的表達情況，選取7 個在幼葉中表達量較高的SBP 基因（SiSBP2、SiSBP3、SiSBP6、SiSBP9、SiSBP12、SiSBP15 和SiSBP19）進行激素和逆境脅迫的響應分析。結果表明（圖3），在5 μmol/L生長素處理條件下，SiSBP2、SiSBP3 和SiSBP19 的表達趨勢為1 h 時顯著下降—3 h 后上升—12 h 時下降，SiSBP6 和SiSBP15 的表達趨勢為3 h 時下降到最低值隨后上升，SiSBP9 的表達趨勢為6 h 時下降到最低值隨后上升，SiSBP12 在生長素處理后一直維持在較低的表達水平；在100 μmol/L 赤霉素處理條件下，除SiSBP3 響應不明顯外，其他6 個基因的表達趨勢均為處理1 h 后表達量逐步下降；在100 μmol/L 茉莉酸甲酯處理條件下，除SiSBP3 響應不明顯外，其他6 個基因的表達趨勢均為表達量逐步下降；在100 μmol/L 脫落酸處理條件下，SiSBP2、SiSBP6 和SiSBP12 在處理1 h 時表達量開始下降，SiSBP9、SiSBP15 和SiSBP19 在處理3 h 時開始下降，SiSBP3 對脫落酸處理無響應；在20%PEG 處理條件下，7 個基因的表達趨勢均為表達量逐步下降；在4 ℃處理條件下，SiSBP2、SiSBP3 和SiSBP12 在處理6 h 時顯著下降，SiSBP6 在處理12 h 時顯著下降，SiSBP9 在處理1 h 時顯著上升隨后逐步下降，SiSBP15 和SiSBP19 表達趨勢為1 h 時下降—3 h后上升—12 h 時下降。整體來看，谷子SBP 轉錄因子家族基因參與多種激素和逆境脅迫響應過程。

2.5 谷子SBP 轉錄因子家族基因miR156 和miR529 靶基因預測

分析SiSBPs 全長cDNA 序列中miR156 和miR529 靶基因位點預測結果，發現13 個SiSBPs 可能存在與miR156 或miR529 相互補的序列，它們分別屬于SBP 家族基因的第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ亞類。其中，SiSBP9 僅含有miR156 位點（位于3'UTR），SiSBP11僅含有miR529 結合位點（位于編碼區），其余11 個均含有靶位點相同或相近的2 個結合位點，且多位于編碼區，說明miR156 和miR529 的靶基因具有保守性（圖4）。

3 結論與討論

SBP 轉錄因子是植物中特有轉錄因子之一，參與植物株型、開花、產量、激素信號轉導、逆境響應等多種生長發育進程的調控，在多個物種中都對其進行了鑒定和分析。前期，宋健等[39]在谷子中共鑒定出19 個SBP 蛋白，并將谷子SBP 蛋白家族分為7 個亞類。本研究利用晉谷21 號的19 個組織器官的轉錄組數據進行分析發現，第Ⅰ亞類基因SiSBP5、SiSBP13、SiSBP16 和SiSBP18 在葉片或穗中有較高表達，水稻SPL16 也聚為這一類，OsSPL16 控制籽粒大小和形狀，該基因的過表達可增加粒寬、粒質量和產量[43]；第Ⅱ亞類基因SiSBP1、SiSBP8 和SiSBP10除在萌發期的種子和幼苗中表達外，在其余器官中均低表達；第Ⅲ亞類基因SiSBP4、SiSBP6、SiSBP7和SiSBP14 在葉和莖中表達量較高，控制水稻株型的關鍵基因OsSPL14 就屬于這一亞類[20-21]，可以將該亞類基因作為今后谷子株型研究的關鍵候選基因；第Ⅳ亞類基因SiSBP2、SiSBP3 和SiSBP11 表達模式與第Ⅲ亞類相似；第Ⅵ亞類基因SiSBP9 為組成型表達；第Ⅶ亞類基因SiSBP15 在葉鞘和莖等組織中有較高表達；第Ⅸ亞類基因SiSBP12 和SiSBP19在根和葉中有較高表達。另外，本研究中SiSBP17并未聚到第Ⅲ亞類，與宋健等[39]的結果略有不同，其總體表達水平低于其他基因。進一步分析19 個SiSBPs 在長農35 號和晉谷21 號中的表達模式，發現SiSBP19 都表現為組成型表達，SiSBP17 都表現為低表達或不表達，SiSBP13 和SiSBP15 都在旗葉中高表達，說明SBP 基因在不同谷子品種中具有保守性，同時由于品種的不同，一些基因的表達有所不同，例如SiSBP16 在長農35 號的幼穗中特異表達，而晉谷21 號中該基因在灌漿期根中特異表達。

SBP 轉錄因子參與多種逆境脅迫應答反應。玉米ZmSPL1、ZmSPL9、ZmSPL12、ZmSPL15、ZmSPL22、ZmSPL26 和ZmSPL29 對急性脫水、鹽、冷和ABA等4 種逆境脅迫均有響應[7]；甜橙CcSBPs 對高溫、低溫、鹽和傷流等4 種不同逆境脅迫中表現出多重響應模式[44]。前期，宋健等[39]對谷子SBPs 在ABA 和PEG 這2 種逆境脅迫下的表達模式分析表明，2 種脅迫處理后該家族基因在葉和莖中均上調表達。本研究分析了7 個SBP 基因（SiSBP2、SiSBP3、SiSBP6、SiSBP9、SiSBP12、SiSBP15、SiSBP19）在脫落酸、干旱和冷處理下的表達量變化，4 ℃處理下，除了SiSBP9、SiSBP15 和SiSBP19 在處理后1 h 或3 h 表達上調外，其余基因表達均下調，其中，SiSBP3、SiSBP9 和SiSBP19 的啟動子區存在低溫響應元件（LTR）；ABA處理下，7 個SiSBP 基因均為下調表達，除SiSBP12外，其他6 個基因的啟動子區存在脫落酸響應元件（ABRE）；PEG 處理下，7 個SiSBP 基因表達模式與ABA 處理相似，其中除SiSBP15 外，其他6 個基因的啟動子區存在干旱響應元件（MBS）。本研究中SiSBPs 對ABA 和PEG 響應結果與宋健等[39]的研究結果不同，但與玉米、甜橙中該家族基因對逆境脅迫的響應是相似的。

結合順式作用元件的預測結果，本研究又選用了3 種激素（IAA、MeJA 和GA3）處理來分析SiSBPs對激素的響應。IAA 處理下，大部分SiSBPs 表現出顯著下降后又上調表達，但總體表達量低于對照，其中，SiSBP2、SiSBP3 和SiSBP19 的啟動子區存在生長素響應元件（AuxRR-core 和TGA-element）；MeJA處理下，SiSBPs 表達量隨著處理時間而逐漸下降，其中除SiSBP6 外，其他6 個基因的啟動子區存在有茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）；GA3處理下，SiSBPs 表達模式與MeJA 處理相似，其中SiSBP2、SiSBP3 和SiSBP19 的啟動子區存在赤霉素響應元件（GARE-motif 和P-box）。這些結果為進一步研究谷子SBP 轉錄因子家族基因參與逆境及激素信號轉導的機制提供了參考。

miR156 和miR529 通過miR156/miR529-SPL模塊調控植物開花、株型建成、穗型發育等[24，30-32]。本研究中，19 個SiSBPs 基因中13 個（68.4%）可能存在miR156 或miR529 的結合位點，這一比例稍高于擬南芥（64.7%）、水稻（57.9%）和玉米（61.3%）[5，7，25]，暗示谷子中可能有更多的SBP 基因通過miR156/miR529-SPL 模塊調控谷子生長發育，miR156/miR529 與13 個SiSBPs 之間的關系有待于進一步試驗驗證。

本研究利用熒光實時定量PCR 分析了19 個SiSBP 基因在7 種組織器官中的表達模式，預測了19 個SiSBPs 啟動子區順式作用元件，發現7 個SiSBPs 在生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯等外源植物激素和ABA、冷、干旱等脅迫處理下表達量發生明顯變化，暗示該基因家族參與了多種激素信號轉導和逆境脅迫響應過程。另外，預測到13 個SiSBPs存在miR156 和miR529 靶位點。研究結果為進一步解析SBP 轉錄因子家族基因參與谷子生長發育及激素和逆境脅迫的響應機制奠定了基礎。