新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑制備及儲存影響因素研究*

朱文娟 魏友華 王 蕊 魏 莉 王志俊 山東省棗莊市婦幼保健院醫學遺傳與產前篩查科 277100

新生兒遺傳代謝病是指由于基因突變引起酶缺陷、細胞膜功能異?；蚴荏w缺陷，從而導致機體生化代謝紊亂，造成中間或旁路代謝產物蓄積或終末代謝產物缺乏而引起一系列臨床癥狀的一組疾病[1-2]。早期篩查、診斷、治療新生兒遺傳代謝疾病能夠有效降低新生兒出生缺陷，是我國出生缺陷三級防控體系的重要組成部分，是提高兒童健康水平和生活質量的重要技術保證[3]。以串聯質譜技術為代表新一代疾病篩查體系，應用于氨基酸、有機酸、脂肪酸和糖代謝異常以及溶酶體貯積癥等新生兒遺傳代謝病篩查，實現了一種檢測方法檢測多種疾病的技術轉變[4]。然而干血斑中的這些生物標記物極易受血斑制備及血斑儲存條件的影響，保證血斑制備和儲存條件穩定性，對于分析干血斑中氨基酸和肉堿濃度尤其重要。但是關于不同制備溫度、紫外線污染及不同儲存溫度對新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑中氨基酸和肉堿含量影響國內鮮有系統研究與報道，故為進一步規范各實驗室室間質量控制，降低篩查假陽性及假陰性出現的可能，提高串聯質譜篩查質量，更好地促進新生兒疾病篩查業務規范開展，有必要對影響干血斑中氨基酸及肉堿穩定性因素進行全面、系統探究。因此，本研究主要探討在串聯質譜技術支持下，研究不同制備溫度、紫外線污染及不同儲存溫度對新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑中氨基酸和肉堿含量影響，以便選擇最佳儲存條件提高串聯質譜篩查質量，更好地促進新生兒疾病篩查業務的規范開展。

1 資料與方法

1.1 標本 參照新生兒疾病篩查采血技術規范要求，為避免人群個體因素對檢測結果產生的影響，標本制作的血液來源為知情同意的健康志愿者。采血部位為肘前靜脈(空腹)，直接將注射器中的全血以定量的形式滴加在濾紙上，利用采血卡制備直徑8mm標準血斑。

1.2 儀器和試劑 采用美國Waters公司生產的TQ Detector串聯質譜儀分析以及美國PerkinElmer公司生產的配套非衍生多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒。

1.3 方法 為研究不同制備溫度對血斑中氨基酸及肉堿含量影響將制備的部分標準新鮮血斑分為4℃、25℃及37℃三組進行制備。血斑制備后，每組從干血斑邊緣取3個復孔進行試驗，每個實驗組進行3次重復實驗，以試劑盒自帶質控品為對照組，通過Waters-TQD串聯質譜儀利用非衍生化法進行干血斑內氨基酸及肉堿含量分析。為研究紫外射線污染對血斑中氨基酸及肉堿含量影響將制備的部分標準新鮮血斑分為25℃制備組與25℃制備過程中紫外燈照射組兩組。血斑制備后，每組從干血斑邊緣取3個復孔進行試驗，每個實驗組進行3次重復實驗，以試劑盒自帶質控品為對照組，通過Waters-TQD串聯質譜儀利用非衍生化法進行干血斑內氨基酸及肉堿含量分析。為研究儲存溫度對干血斑中氨基酸和肉堿含量變化將25℃制備的部分標準血斑根據儲存溫度以及儲存時間分為三組，分別為4℃制備組，-20℃制備組，-80℃制備組。每組檢測時間分別為保存0d、7d、3個月。檢測時，每組從干血斑邊緣取3個復孔進行試驗，每個實驗組進行3次重復實驗，以試劑盒自帶質控品為對照組，通過Waters-TQD串聯質譜儀利用非衍生化法進行干血斑內氨基酸及肉堿含量分析。

2 結果

2.1 不同制備溫度對干血斑中氨基酸及肉堿含量影響 在4℃、25℃及37℃三種溫度條件下對新鮮血斑標本進行制備時，血斑中肉堿含量穩定，未產生顯著差異變化(數據未顯示)；而血斑中部分氨基酸含量則產生顯著性變化。如表1所示：37℃制備組中ARG含量顯著高于4℃制備組與25℃制備組(P<0.05)；但是4℃制備組與25℃制備組ARG含量比較無統計學差異；而37℃制備組中ORN含量顯著低于4℃制備組(P<0.05),但25℃制備組與37℃制備組及4℃制備組分別比較時，各組間無統計學差異。

表1 不同制備溫度對新鮮血斑中氨基酸含量影響

2.2 紫外線污染對干血斑中氨基酸及肉堿含量的影響 為研究血斑制備過程中受到紫外線污染時對血斑中氨基酸及肉堿含量的影響，筆者研究了血斑在25℃制備、25℃制備時受到紫外線照射污染兩種情況下干血斑中氨基酸及肉堿含量變化。如表2、3所示，25℃制備時受到紫外線污染組干血斑中ARG含量顯著高于25℃制備時未受紫外線污染組(P<0.05)，兩組中其他氨基酸含量及肉堿含量無統計學差異。

表2 紫外射線污染對血斑中肉堿含量影響

表3 紫外射線污染對血斑中氨基酸含量影響

2.3 儲存溫度對干血斑中氨基酸和肉堿含量影響 如表4所示，4℃、-20℃及-80℃對制備的干血斑密封保存7d，干血斑中氨基酸及肉堿指標含量未有顯著性變化；隨著保存時間到90d時，與-20℃及-80℃保存條件相比，4℃密封儲存干血斑時，GLY、MET、ORN以及肉堿中C2、C3均有顯著性降低，但是C0表現出顯著性升高，存在統計學差異。但是-20℃與-80℃對密封保存的干血斑中氨基酸(除ORN外)及肉堿含量(除C16外)變化無顯著性統計學差異。

表4 不同儲存時間對干血斑中氨基酸和肉堿含量影響

3 討論

新生兒疾病篩查在我國出生缺陷三級防控體系中起著重要作用。串聯質譜技術作為新一代疾病篩查體系代表有效推動了新生兒疾病篩查的自動化和篩查效率，使得篩查的疾病種類也越來越多，新生兒疾病篩查和診斷工作也面臨越來越多的問題亟待解決。其中分析前質量問題(主要涉及標本采集時間、采集方式、運輸方式以及儲存方式等)涉及環節多，人為影響因素大，不易標準量化而越來越成為影響新生兒疾病篩查質量的主要影響因素[5]。

電噴霧離子質譜檢測經同位素標記的氨基酸是全世界范圍內普遍采用的新生兒篩查法，衛生部臨床檢驗中心串聯質譜檢測氨基酸和肉堿的室間質量評價結果表明串聯質譜檢測氨基酸和?；鈮A的質量水平差異較大[6]。

早期國內李啟亮等[7]研究表明：血斑制備后儲存時間對多數氨基酸含量沒有明顯影響，但是GLY隨標本儲存時間延長而含量下降，4℃儲存3個月時與新鮮干血斑標本比較存在顯著統計學差異。本研究結果也證實，與新鮮干血斑相比，4℃保存3個月后，血斑中除GLY出現顯著性下降外，ARG、MET、VAL也表現出同樣的變化趨勢，且存在統計學差異。同時國外研究表明：在長期儲存的干血斑中，游離肉堿含量在前5年的時間里每年增加7.6%，而在隨后的時間里每年降低1.4%，氨基酸含量則每年均存在一定程度的損失，但不同氨基酸每年下降程度不同，表明氨基酸及?；鈮A在干血斑中的含量呈現出不穩定性[8]。另外，Golbahar J等研究了干血滴濾紙片法采集樣品短期穩定性，考察了新生兒先天代謝性疾病血樣在極端條件下(溫度和濕度)，7種氨基酸和10種?；鈮A的含量變化，發現溫度或濕度過高均大大降低檢測的靈敏度，血樣最好是低溫干燥保存，可以顯著降低篩查過程中假陽性的出現[4]。

另一方面，本研究發現：在4℃、25℃及37℃三種溫度條件下對新鮮血斑標本進行制備時，血斑中肉堿含量穩定；與4℃相比，37℃制備血斑時，血斑中ARG含量上升45%，而ORN含量則下降8.8%，兩個指標具有統計學差異。與郭元芳等人[9]對干血斑中ARG濃度與環境溫度和濕度變化呈現反比例關系的結論不一致，表明環境濕度可能對干血斑中氨基酸濃度的影響更大。與25℃制備干血斑中氨基酸及肉堿含量相比，在25℃制備過程中受到紫外線污染時，血斑中肉堿含量未有明顯變化，但血斑中ARG含量上升23%，ORN含量下降11%，兩個指標差異具有統計學意義。隨著儲存時間延長，干血斑中各氨基酸指標含量存在一定程度降低，尤其以ARG、VAL含量降低幅度明顯，這可能與干血斑中水解酶濃度增加有關；干血斑肉堿指標含量保持穩定；但是在4℃條件下儲存標本時，血斑中C0含量在3個月后上升約40%，這與之前國外研究結果相符合，國外研究中同樣指出C0這種含量趨勢變化與?；鈮A酯化體系的水解有關[4，10]。同時，本研究發現，4℃儲存干血斑時，隨著時間推移，MET含量與C2含量在3個月后急劇降低為原來的50%，這種MET與C2的含量下降在-20℃及-80℃儲存條件下并未出現，該種情形的出現有待于進一步的研究發現。

本研究結果表明：新生兒遺傳代謝性疾病篩查干血斑制備過程中溫度變化對于干血斑中ARG與ORN含量影響顯著，同時干血斑制備過程中受到紫外線污染時導致血斑中ARG含量的增加，但是制備溫度及紫外線污染對血斑中肉堿含量影響未有統計學差異。因此新生兒疾病篩查干血斑在制備時應盡量保持室內溫度恒定(室溫25℃)，避免我國北方因冬夏季節差異影響干血斑中檢測物質含量的變化，同時避免受到紫外射線污染以降低對血斑中氨基酸含量的影響。本實驗結果表明，-20℃條件對制備的干血斑密封保存能很好保證干血斑中氨基酸及肉堿含量的穩定性，目前實驗室從血斑制備至實驗室完成檢測時間跨度為1周是合適的時間范圍，也能滿足日常實驗檢測質控需求。