miRNA-155、miRNA-21和Th1、Th2、Th17相關細胞因子在急、慢性布魯菌病患者中的表達及其意義

徐 崢,謝松松，阿孜古麗·阿布來提,譚風雷,張躍新

（1新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054；2石河子大學第一附屬醫院，新疆 石河子 832000）

布魯菌?。˙rucellosis，以下簡稱布?。?，是全球范圍內重要的人畜共患性傳染病之一。21世紀以來我國布病發病率呈迅速增長的趨勢[1]，已成為嚴重影響農牧區人民健康和經濟發展的重要地方性傳染病。布魯菌作為胞內寄生菌，可通過其免疫調節機制實現免疫逃逸進而造成機體慢性感染，T細胞亞群及其細胞因子共同組成的免疫調節網絡在其中發揮著不可替代的作用。既往的研究認為，Th1類細胞及其相關細胞因子多表達在布病急性期，具有促炎作用[2-3]，Th2類細胞及其相關細胞因子多表達在布病的慢性期，發揮抑炎作用，不利于機體對布魯菌的清除[4-5]，而Th17類細胞及其細胞因子在布病中的表達目前尚無一致性報道。隨著研究的深入，人們還發現一類內源性基因非編碼的單鏈小分子RNA（miRNAs），可通過整合進RNA誘導的沉默復合體（RISC）的方式與靶mRNA的結合，降解靶mRNA或抑制蛋白質的翻譯從而調控基因表達，影響細胞的分化、增殖和凋亡[6]，T細胞亞群及其細胞因子均可受到miRNAs的調控，影響其分泌和表達。其中又以miRNA-155、miRNA-21與Th1、Th2類細胞關系密切：miRNA-155可下調已經活化的IFN-γ受體，促使Th0向Th1分化[7]，同時又可抑制靶基因Jarid 2，增強Th17的促炎效應[8]。miRNA-21通過在T細胞上表達Sprouty1，刺激Th2的分化[9]，同時可抑制樹突狀細胞產生IL-12，下調Tbet和IFN-γ表達量，抑制Th1的分化。布病作為一種與免疫緊密關聯的感染性疾病，機體應對感染的過程中也可能存在miRNAs與T細胞亞群細胞因子間復雜的調控網絡，基于本團隊學者[10-12]在對布病感染后機體Th1/Th2類免疫反應的研究基礎之上，本研究通過分析miRNA-155、miRNA-21以及細胞因子IL-18、IL-33等指標，觀察布病急、慢性期患者miRNAs以及Th1、Th2和Th17相關細胞因子的表達，探討以上指標在不同分期的布病患者中表達的免疫特點與臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究屬于前瞻性設計，于2020年1-11月選取石河子大學醫學院第一附屬醫院收治確診的布病患者共73例。急性期患者42例，其中男性22例，女性20例；慢性期患者31例，其中男性19例，女性12例；健康對照者30例，其中男性16例，女性14例。所有病例參照2017年中華傳染病雜志頒布的《布病診療專家共識》[13]進行診斷，臨床分期以病程在6個月以內為急性期；病程超過6個月為慢性期。

1.2 主要試劑及儀器Human Th Cytokine Panel試劑盒購自美國Biolegend公司，TaqDNA聚合酶和dNTP，熒光實時定量PCR試劑，逆轉錄試劑盒購自天根公司。

1.3 標本采集與處理細胞因子的采集：分別采集清晨空腹狀態的急、慢性布病患者以及健康對照者的外周靜脈血5 mL，其中采用抗凝管采集的血標本送往流式細胞儀進行檢測，不含抗凝劑管的血標本離心后分離血清，于-80℃備用。miRNAs的采集：分別采集清晨空腹狀態的急、慢性布病患者以及健康對照者的外周靜脈血5 mL，離心后留取上層血漿樣本1 mL至無RNA酶的EP管中，于-80℃備用，剩余血樣用于提取外周血單個核細胞。

1.4 CBA法檢測細胞因子水平收集布病患者清晨靜脈血標本4 mL，4 000 r/min離心5 min，分離血清，用移液槍將血清分裝移至1.5 mL的EP管中，-80℃冰箱保存備用。采用CBA技術檢測急、慢性期布病患者及對照者血清中Th1類細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-18）、Th2類細胞因子（IL-10、IL-33）和Th17類細胞因子（IL-17）水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，并進行質控。用流式細胞分析儀讀取數據，根據標準曲線計算樣本中各細胞因子的濃度值。

1.5 qRT-PCR法檢測miRNAs水平對外周血單個核細胞提取總RNA，按照說明書進行反轉錄操作，所得cRNA于-20℃條件保存備用。以U6為內參（引物primer express 2.0軟件設計由上海生工生物技術有限公司提供），根據mirbase數據庫，分別檢測miRNA-155-5p以及miRNA-21-5p，采用PCR儀（美國ABI 7500型）進行定量檢測，擴增條件為：95℃10 min，(95℃10 s,58℃30 s,72℃10 s)40個循環。反應后分析熔解曲線，采用2-△△Ct法計算miRNAs的相對表達量。

1.6 統計學處理采用SPSS26.0統計軟件進行結果分析。計量資料符合正態分布且方差齊，采用（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Th1相關細胞因子在急、慢性布病患者以及健康對照者中的表達與對照組相比，急、慢性期布病組IFN-γ、TNF-α、IL-18水平均升高（P均＜0.05）；與急性組相比，慢性組IFN-γ、TNF-α、IL-18水平均下降（P均＜0.05）（表1）。

表1 3組人群血清Th1類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

表1 3組人群血清Th1類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

組別急性組慢性組對照組F值P值例數42 31 30 Th1類細胞因子IFN-γ 71.98±29.57 28.70±17.23 6.39±2.45 89.91 0.00 TNF-α 45.01±29.68 20.47±14.94 5.25±1.86 33.85 0.00 IL-18 366.62±218.54 153.88±53.44 57.31±36.54 43.86 0.00

2.2 Th2相關細胞因子在急、慢性布病患者以及健康對照者中的表達與對照組相比，急、慢性期布病組IL-10、IL-33水平均升高（P均＜0.001），與急性組相比，慢性組IL-10、IL-33水平升高（P均＜0.05）（表2）。

表2 3組人群血清Th2類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

表2 3組人群血清Th2類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

組別急性組慢性組對照組F值P值例數42 31 30 Th2類細胞因子IL-10 41.37±9.85 45.31±5.08 5.43±1.45 315.58 0.00 IL-33 93.91±48.04 124.24±86.55 11.80±5.94 32.50 0.00

2.3 Th17相關細胞因子在急、慢性布病患者以及健康對照者中的表達與對照組相比，急、慢性組IL-17表達均升高（P均＜0.05），與急性組相比，慢性組IL-17表達下降（P＜0.05）(表3）。

表3 3組人群血清Th17類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

表3 3組人群血清Th17類細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

組別急性組慢性組對照組F值P值例數42 31 30 Th17類細胞因子IL-17 19.06±11.81 14.02±2.27 5.90±2.84 24.83 0.00

2.4 miRNA在急、慢性布病患者以及健康對照者中的表達與對照組相比，急、慢性組miRNA-155表達均增高（P均＜0.01）；與慢性組比較，急性組miRNA-155的表達增高顯著（P＜0.01）。與對照組相比，急、慢性組miRNA-21表達均增高（P均＜0.01）；與慢性組比較，急性組miRNA-21表達變化差異無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 miRNA-155和miRNA-21在3組人群中的相對表達水平（±s，pg/mL）

表4 miRNA-155和miRNA-21在3組人群中的相對表達水平（±s，pg/mL）

組別急性組慢性組對照組F值P值例數15 15 15 miRNA-155-5p 2.14±0.30 1.40±0.19 0.98±0.12 5.14 0.00 miRNA-21-5p 2.33±0.34 2.10±0.30 0.99±0.16 7.60 0.00

2.5 各檢測指標間的相關性分析IL-18表達水平與IFN-γ、TNF-α的表達水平均呈正相關（r=0.664、0.659，P均＜0.01）。IL-33表達水平與IL-10的表達水平呈正相關（r=0.554，P＜0.01）。miRNA-155表達水平與IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-17的表達以及ESR、CRP均呈正相關（r=0.747、0.689、0.678、0.673、0.501、0.591，P均＜0.01）。miRNA-21表達水平與IL-10、IL-33的表達及ESR、CRP均呈正相關（r=0.847、0.643、0.475、0.558，P均＜0.01）。

3 討論

布魯菌作為胞內菌，通過胞內寄生和復制的方式調節和逃逸機體免疫，妨礙機體對其清除，這往往是布菌導致多臟器系統受損、布病遷延難愈的原因之一。機體免疫對其清除主要依賴于細胞免疫，T細胞亞群及相關細胞因子在其中發揮了重要的作用。本研究結果顯示，急、慢性布病患者的Th1、Th2和Th17類細胞因子表達均升高，在急性期以Th1和Th17類細胞因子表達為主，慢性期以Th2類細胞因子表達為主。在細胞因子的檢測中，除了經典Th1細胞因子IFN-γ和TNF-α，本次研究還發現IL-18主要表達在布病急性期，與IFN-γ和TNF-α關聯性較強，顯現出表達趨勢一致的現象。而IL-33在慢性期顯著增高，與Th2類細胞因子IL-10表達趨勢一致。已有研究證實IL-18和IL-33分別作為Th1和Th2類細胞因子，在多種疾病中參與了機體免疫Th1/Th2類反應[14-15]，本次結果也證實，在布病中IL-18和IL-33分別參與了Th1和Th2類反應，可協同經典細胞因子，作為研究機體Th1/Th2類免疫反應的靶標。

此外，綜合細胞因子以及miRNAs的檢測結果提示，在布病急性期，以miRNA-155和Th1、Th17類細胞因子表達為主。其中，miRNA-155與Th1類細胞因子IFN-γ關聯性最強，基于研究已證實miRNA-155能夠通過上調IFN-γ的分泌，進而促進Th1類細胞表達[16]，由此可以推測，miRNA-155不僅參與到布菌感染后的機體免疫的反應中，并可能通過上調Th1細胞或細胞因子IFN-γ的表達，增強Th1和Th17類免疫效應。與miRNA-155在布病急性期的顯著增高不同，miRNA-21的表達呈現出在急、慢性期均增高的特點，在其他疾病的研究中證實，miRNA-21可能與疾病的慢性化有關[17]，但在本研究中未發現miRNA-21在布病急、慢性期的表達差異。

CRP和ESR作為常規檢測指標已應用于布病的臨床診斷中，它們均在布病急性期升高明顯，其檢測值反映出布病感染后的炎癥變化，具有良好的敏感度和特異性[18-19]。在本次相關性分析中提示，miRNA-155和miRNA-21均與ESR和CRP存在正相關關系，這不僅提示miRNAs的表達與布菌感染后機體的炎癥變化關系密切，并且綜合上述分析或可推測，在布病中，miRNAs可通過調控細胞因子進而影響T細胞分化極性，最終影響布病的發生和發展。

綜上所述，miRNA-155和miRNA-21以及Th1、Th2和Th17類細胞因子在布病患者中存在異常表達，其表達水平與布病的急、慢性分期緊密相關，調控因子miRNA-155與Th1類細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-18）和Th17類細胞因子（IL-17）之間存在一定的協同關系，進一步提示在布病中可能存在miRNAs調節細胞因子影響Th細胞分化進而影響布病的發生與分期。但由于本次研究的樣本量相對較少，在下一步的深入研究中將通過對miRNAs與Th細胞分化信號通路的研究，進一步發現在急、慢性患者中上述不同調節位點的作用與機制，以期為布病的分期和治療提供新的靶點。