基于網絡藥理學探討麝香通心滴丸治療心力衰竭的潛在機制

權 力，牛文豪，趙 健，張艷達，賀治青，梁 春

心力衰竭(heart failure，HF)指因各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征，是各種器質性心臟病的終末期表現，也是心血管疾病中最常見的類型[1]。流行病學調查表明，心力衰竭的發生率隨著老齡化的進展逐年上升，且該病的死亡率可達50%，一旦出現心力衰竭，大部分病人心力衰竭呈進行性惡化[2]。目前心力衰竭的臨床治療方法包括藥物干預、血運重建及心臟移植等，其中藥物干預主要有血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ抑制劑(ARB)、醛固酮受體拮抗劑、β受體阻滯劑和利尿劑等[3-4]。但單純西藥干預存在一定不良反應，尤其是對低血壓慢性收縮性心力衰竭，應用ACEI、ARB、β受體阻滯劑等可導致基礎血壓進一步下降，引發機體各臟器低灌注表現，反而增加病人死亡率[5]。

近年來中醫對心力衰竭的研究逐漸深入。中醫學將心力衰竭歸為“怔忡”“喘證”“痰飲”“水腫”等范疇，認為心力衰竭屬本虛標實之證，其中本虛以氣虛、陽虛、陰虛為主，而標實則以血瘀、水飲、痰濁為主[6]，故中醫治療多采用益氣溫陽、活血利水的方法[7]。一些經典的益氣活血藥物，如黃芪、丹參、人參、紅花、益母草、茯苓、葶藶子等，以及芪參益氣滴丸、芪藶強心膠囊、生脈注射液等溫陽利水藥物，已被證明能有效緩解心力衰竭癥狀并減少副作用[8]。一些研究著眼于尋找新的藥物治療心力衰竭，近年來麝香通心滴丸也越來越多地用于心力衰竭的治療中[9-10]。麝香通心滴丸的組方是依據《蘇沈良方》中的至寶丹和傳統名方六神丸加減化裁而來，其藥物組成主要包括人工麝香、牛黃、人參莖葉總皂苷、丹參、熊膽粉、冰片、蟾酥等[11]。已有研究證明，麝香通心滴丸可改善心力衰竭病人癥狀，提高心臟射血分數，延緩心臟重構，并降低心力衰竭相關標志物水平[10，12]。但麝香通心滴丸的成分較多，作用機制較復雜，目前因受各種條件限制未能完全明確，故本研究擬通過網絡藥理學方法探究麝香通心滴丸治療心力衰竭的潛在機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及其靶點篩選 應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥綜合數據庫(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/search)檢索麝香通心滴丸主要成分：麝香、牛黃、人參葉、丹參、熊膽、冰片、蟾酥。將化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)閾值設為≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)閾值設為≥0.18篩選有效成分，并使用TCMSP數據庫獲得這些化合物對應的靶點。

1.2 疾病靶點收集 以“heart failure”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，收集與心力衰竭相關的作用靶點。

1.3 篩選靶點并構建化合物-靶點網絡 將所篩選出的藥物成分對應靶點與心力衰竭相關的全部靶點進行交集，輸入Cytoscape 3.6.0軟件構建化合物-靶點網絡，以明確疾病靶點與藥物靶點之間的關系。使用Cytoscape構建的化合物-靶點網絡中，每個節點代表基因或分子，節點之間的連接代表這些生物分子與基因之間存在相互作用，節點的度值代表節點與節點相連的數目。

1.4 構建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡 為進一步探究靶點之間的相互作用，將交集所得的共同靶點上傳至STRING數據庫(Version 11.0，https://www.string-db.org/)，構建PPI網絡。物種選擇為Homo sapiens，其余參數保持默認設置，獲取PPI網絡。

1.5 分析潛在的生物過程與通路 利用R Project軟件及Bioconductor數據庫的org.Hs.eg.db程序包將共同靶點的基因symbols轉變為Entrez IDs，隨后利用ClusterProfiler程序包對網絡進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，以尋找潛在的生物過程與通路。設定P<0.05，并按照涉及靶點數目降序排序，獲取GO富集分析中分子功能(molecular function，MF)、細胞組成(cellular component，CC)和生物過程(biological process，BP)的前10個條目以及KEGG富集的前20條信號通路。

2 結 果

2.1 藥物有效成分篩選結果 通過TCMSP、TCMID數據庫檢索到麝香、牛黃、人參葉、丹參、熊膽、冰片、蟾酥中的化合物共547個，其中麝香59個，牛黃19個，人參葉126個，丹參202個，熊膽28個，冰片32個，蟾酥81個。

以OB≥30%且DL≥0.18為標準篩選出化合物92個，其中麝香5個，牛黃5個，人參葉9個，丹參65個，熊膽1個，冰片3個，蟾酥6個，其中膽固醇為麝香、蟾酥的共有成分，去氧膽酸為熊膽、牛黃共有成分。部分化合物情況見表1。

表1 麝香通心滴丸部分活性成分

(續表)

2.2 共同靶點篩選結果 通過檢索GeneCards數據庫，得到與心力衰竭相關的作用靶點13 194個。使用TCMSP數據庫檢索藥物中各有效成分對應的所有靶點，經去重共得到靶點154個。將以上靶點進行交集，合并后得到靶點140個，對應的藥物有效成分78個。2.3 化合物-靶點網絡構建 采用Cytoscape 3.6.0軟件構建化合物-靶點網絡圖(見圖1)。該網絡包含78個化合物節點、140個靶點節點和1 075條邊，其中紅色節點表示來自丹參的化合物，粉色節點表示來自蟾酥的化合物，紫色節點表示來自牛黃的化合物，深綠色節點表示來自麝香的化合物，藍色節點表示來自人參葉的化合物，黃色節點為多種藥物共有的化合物，綠色節點表示靶點。

圖1 麝香通心滴丸主要成分-靶點網絡圖

根據網絡拓撲學性質可知，化合物或藥物靶點擁有的節點越多，在整個網絡中所起到的作用就越關鍵，因此，本研究篩選節點度較大的節點進行分析?；衔?靶點網絡中的部分關鍵節點及其拓撲學性質見表2。

表2 化合物-靶點網絡中的部分關鍵節點及其拓撲學性質

通過分析化合物節點度值，可見排名前5位的化合物分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮，他們分別能與68個、54個、42個、39個、37個靶點蛋白發生作用，其化學結構圖詳見圖2。觀察靶點度值可見，排名前5位的靶點有前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、核受體共激活因子1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、電壓門控鈉通道5α亞基(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A)、β2腎上腺素能受體(adrenoceptor beta 2，ADRB2)、核受體共激活因子2(nuclear receptor coactivator 1，NCOA2)，他們分別能與55個、35個、31個、31個和31個化合物發生相互作用，這一結果體現了中藥多靶點的特性。

圖2 化合物節點度值前5位化合物結構圖(A：槲皮素；B：木犀草素；C：山奈酚；D：丹參酮-ⅡA；E：鼠尾草酚酮)

2.4 PPI網絡構建 應用STRING數據庫構建PPI 網絡，并采用Cytoscape 3.6.0軟件可視化(見圖3)，其中線段顏色越深代表其互作評分越高。PPI網絡圖中包含139個節點、1 905條邊，同時得到網絡中關鍵靶點的頻次。根據“度值>均值”篩選出關鍵節點19個， 包括：AKT1、CASP3、AR、EGFR、BCL2L1、CCND1、APP、FOS、CASP8、ERBB2、IL6、CASP9、ESR1、EDN1、ACHE、JUN、MAPK1、CCNB1、CDK4。度值最高的是AKT1，度值為82；其次為CASP3，度值為55；AR、EGFR度值均為47；BCL2L1度值為45。度值大的靶點通常在網絡調控中起著關鍵作用，很可能是麝香通心滴丸治療心力衰竭的關鍵靶點。

圖3 麝香通心滴丸靶點PPI網絡

2.5 GO富集分析與KEGG富集分析 GO 富集分析結果(見圖4)中，生物過程主要包括細胞對藥物的反應(cellular response to drug)、循環系統血管過程(vascular process in circulatory system)、對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、管徑的調節(regulation of tube diameter)、血管直徑的調節(regulation of blood vessel diameter)等；分子功能主要包括神經遞質受體活性(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶聯氨受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、突觸后神經遞質受體活性(postsynaptic neurotransmitter receptor activity)、腎上腺素能受體活性(adrenergic receptor activity)等，參與了細胞中膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomain)、膜區(membrane region)、突觸后膜(postsynaptic membrane)等區域組成。KEGG富集信號通路(見圖5、圖6)主要包括：神經活動配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。

圖4 麝香通心滴丸治療心力衰竭的GO富集分析

圖5 麝香通心滴丸治療心力衰竭的KEGG富集分析柱狀圖

圖6 麝香通心滴丸治療心力衰竭的KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

經過篩選，可見麝香通心滴丸主要活性物質包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮等。槲皮素、山奈酚主要來源于人參葉，木犀草、丹參酮-ⅡA、鼠尾草酚酮主要來源于丹參等。先前一些研究發現，人參的主要成分人參莖葉總皂苷能夠通過清除體內自由基和抗氧化的作用，減輕缺血心肌的再灌注損傷，進一步改善心肌功能[13]；丹參具有活血化瘀、抗凝、擴血管、改善微循環、通脈養血等作用，并能夠防止和減輕缺氧心肌超微結構的變化，對缺氧心肌有保護作用，還可改變血液流變學性質，降低血液黏稠度，并能增加心肌收縮力，使心排血量增加，擴張血管，同時使腎動脈血流量增加，尿量增多，從而減輕心臟前后負荷，發揮良好的抗心力衰竭作用[14-15]。此外，麝香通心滴丸中的其他成分，如麝香能夠改善血管內皮細胞功能，促進受損心肌細胞代謝水平恢復，拮抗腎素-血管緊張素系統激活，延緩心室重構進程[16]；蟾酥在抗炎、增強心肌收縮力、擴張冠狀動脈等方面也具有一定的作用[17]。

現代醫學認為心臟能量代謝障礙、心肌纖維化、心室重構及神經內分泌因子改變等是促進心力衰竭的重要因素[18]。麝香通心滴丸具有芳香益氣通脈、活血化瘀止痛之功效，通過GO富集分析，可見麝香通心滴丸治療心力衰竭的主要過程有調節血管直徑、改變激素作用、改善代謝等。通過KEGG富集分析可見其涉及的主要通路有神經活動配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、人巨細胞病毒感染通路等。

神經活動配體-受體相互作用通路是神經系統疾病，如抑郁、焦慮、帕金森病中起重要作用的通路[19-20]。神經活性類固醇是神經組織中具有活性的類固醇，可通過與細胞內受體結合而實現其基因作用，增強或抑制神經元的活性[21]。有研究發現該通路在心臟疾病中也起作用，Wang等[22]發現在冠狀動脈搭橋手術中，應用七氟醚可通過調節該途徑影響γ-氨基丁酸(GABA)受體，實現對心臟的保護作用；Bai等[23]應用蛋白質組學-代謝組學綜合分析方法分析心肌梗死SD大鼠血液和左心組織，發現心肌梗死后心肌損傷與此通路密切相關，表明該通路在心臟損傷過程中也起重要作用。一些網絡藥理學研究也發現使用芪參顆粒[24]、紅景天[25]等藥物治療心臟疾病時也涉及此通路，提示麝香通心滴丸治療心力衰竭時也可能通過此機制發揮作用。

PI3K/Akt通路可參與多種細胞功能調節，如細胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉運等，也參與癌癥的發生進展，PI3K與生長因子受體[如血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子受體-1(EGFR)、肝細胞生長因子(HGF)等]結合后，可改變Akt的蛋白結構并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物的活性，從而調節多種細胞功能[26]。近年來一些研究也發現，該通路在心血管系統中也起重要作用，Vega等[27]證明PI3K/Akt通路是心臟生理性生長最關鍵的分子機制，通過運動或基因層面激活PI3K，可產生心臟保護作用并直接對抗病理性心臟生長；Lv等[28]研究發現6-姜辣醇(6-Gingerol，6-G)可通過激活該通路并抑制凋亡改善心肌缺血再灌注損傷；Chen等[29]使用紅景天苷處理內毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導的大鼠體內外心臟損傷模型，發現該藥物可通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑，對內毒素大鼠產生心臟保護作用。以上研究提示PI3K/Akt通路也可能是麝香通心滴丸發揮心臟保護作用的重要途徑。

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一種β-皰疹病毒，其感染可累及宿主機體各器官和系統，病變范圍可從輕微無癥狀感染直到嚴重缺陷或死亡[30]。CMV感染與冠心病密切相關。一項系統回顧研究表明，巨細胞病毒感染病人未來心血管疾病的相對風險可增加22%，約13.4%的心血管疾病發病率可歸因于巨細胞病毒感染[31]；有研究發現CMV感染的內皮細胞在動脈粥樣硬化的發生發展中起著重要作用：當病毒在血管壁上傳播時，可觸發動脈粥樣硬化斑塊中免疫系統激活，并導致內皮功能障礙[32-33]。通過分析CMV感染的相關通路可見其對心臟疾病的發展起到重要作用，這也可能是麝香通心滴丸發揮治療作用的重要通路。

4 結 論

通過網絡藥理學分析可見，麝香通心滴丸中的有效成分可能通過神經活動配體-受體相互作用、PI3K/Akt信號通路、人巨細胞病毒感染等機制，對心力衰竭產生良好的治療作用，未來可通過基礎實驗研究進一步驗證。