兩個產地洋蔥的UHPLC圖譜分析及前列腺素A1含量測定

王曉婷 譚 超 王燕華 秦太峰 張乃明, 李芳艷

(1. 云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2. 云南省土壤培肥與污染修復工程實驗室，云南 昆明 650201；3. 云南農業大學資源與環境學院，云南 昆明 650201)

洋蔥(AlliumcepaL.)又稱為球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭，為石蒜科蔥屬植物。在中國南北均有種植，由于產地、品種、氣候環境、土壤等因素的影響，洋蔥品質各異。洋蔥中含有丙基二硫等硫化物[1]、芹菜素等黃酮類化合物[2-3]、蒜氨酶等酶類[4]、螺甾烷醇型和呋甾烷醇型的甾體皂苷化合物[5]、含氮化合物[6]以及葡萄糖[7]等多種活性成分。除此以外，洋蔥還是極少數富含前列腺素(Prostaglandin, PG)的蔬菜之一[8]。洋蔥中的PG主要包括PGA1、PGA2、PGB1、PGE1和PGF1α等[9]，具有抗炎、抗氧化、殺菌、降血壓、降血糖及預防心腦血管疾病等作用[10-11]。目前對洋蔥活性成分的研究主要集中在黃酮、多糖、含硫化合物等[12-14]，PGA1更多被應用于臨床治療[15]，而云南與黑龍江洋蔥化學成分含量的區別及PGA1含量尚不明確。

超高效液相色譜(Ultra-High Pressure Liquid Chromatography, UHPLC)相比HPLC具有更高效率、超快速、高靈敏、應用范圍廣及有機溶劑用量少等優點，被廣泛用于中藥材質量控制[16]。試驗擬采用UHPLC測定兩個產地洋蔥的化學成分含量與PGA1含量，以期為洋蔥后續開發利用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 樣品

共采集兩個產地(云南省紅河州和黑龍江省齊齊哈爾市)23批洋蔥樣品，均采集自2020年(表1)。

表1 洋蔥品種與產地?

1.1.2 主要試劑

PGA1標準品(CAS：14152-28-4)：純度98%，北京元寶山色譜科技有限公司；

甲醇(CAS：67-56-1)、七氟丁酸(CAS：375-22-4)：色譜純，美國Fisher公司；

超純水:南京歐鎧環境科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜系統：Thermo Scientific UltiMate 3000型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

色譜柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)型，北京迪馬歐泰科技發展中心；

高速粉碎機：JP-500C型，浙江久品工貿有限公司；

分析天平：ME204T/02型，梅特勒—托利多國際貿易(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2B型，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理 新鮮洋蔥切碎于50 ℃鼓風干燥12 h，粉碎后過100目篩。取洋蔥粉0.5 g置于具塞錐形瓶中，加5 mL甲醇，超聲(功率120 W、頻率40 kHz)提取30 min，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾器過濾，即為洋蔥PGA1供試品溶液。

1.3.2 PGA1對照溶液的制備 準確稱取PGA1標準品1.00 mg，用甲醇稀釋并定容至10 mL，制成0.1 mg/mL的標準溶液。

1.3.3 PGA1含量測定 參照孫啟良等[17]的方法，修改如下：

色譜柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，3.0 μm)，流動相：A為0.1%七氟丁酸水溶液，B為甲醇；流速0.6 mL/min，梯度洗脫(0～5 min，5% B；5～35 min，5%～95% B；35～40 min，95% B；40～42 min，95%～5% B；42～47 min，5% B)。柱溫35 ℃，平衡時間0.5 min，進樣體積5.0 μL；UV檢測器檢測波長254 nm。

1.3.4 方法學考察

(1) 精密度試驗：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，供試品溶液適量，重復進樣6次。以PGA1為參照峰，計算PGA1峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。

(2) 穩定性試驗：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，供試品溶液適量，在室溫條件下(20～25 ℃)放置0，2，4，8，12，24 h，進樣。以PGA1為參照峰，計算PGA1峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。

(3) 重復性試驗：取制備的洋蔥(W)樣品溶液，制備6份供試溶液后進樣。以PGA1為參照峰，計算PGA1峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差。

1.4 數據處理

利用TBtools 1.05進行匹配矩陣繪制，SPSS 24.0進行Pearson相關性及聚類分析對比不同產地不同洋蔥樣品之間化學成分的共性和差異性，SIMCA14.0進行PCA及OPLS-DA分析，Origin 2019b進行PGA1含量分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗 PGA1峰的相對保留時間RSD為1.01%，相對峰面積RSD為2.13%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩定性試驗 PGA1峰相對保留時間RSD為0.34%，相對峰面積RSD為2.71%，表明供試品溶液在室溫條件下保持穩定。

2.1.3 重復性試驗 PGA1峰相對保留時間RSD為1.21%，相對峰面積RSD為3.25%，表明該方法重復性良好。

2.2 基于UHPLC洋蔥化學成分含量圖譜

取23批洋蔥樣品進行UHPLC測定，得到洋蔥樣品疊加圖譜并對共有峰標示(圖1)。23批洋蔥樣品共有73個共有色譜峰，出峰時間為1～48 min。對比不同批次洋蔥同一保留時間色譜峰，部分色譜峰具有差異，說明不同產地洋蔥間化學成分含量具有差異。

13. 前列腺素A1

2.3 化學成分分析

對UHPLC圖譜每個峰進行積分峰面積分析(圖2)，T、C、J、D等樣品檢出化學成分積分總峰面積較大。共有色譜峰中12，18，35，51，60號峰面積較大較明顯分辨，說明這些峰所對應的化學成分相對含量較高。通過對比發現云南洋蔥的這些峰平均峰面積均比黑龍江洋蔥高，12，18，35，51，60號均分別高出23.84%，13.32%，21.12%，40.77%，51.51%。且云南洋蔥檢出的平均總峰面積為12 916 919，黑龍江洋蔥檢出的平均總峰面積為10 546 150，云南洋蔥比黑龍江洋蔥平均總峰面積高出22.48%，表明云南洋蔥所含化學成分含量比黑龍江洋蔥更高。

圖2 洋蔥UHPLC指紋圖譜檢出化學成分總峰面積圖

2.4 Pearson相關性及聚類分析

對23批洋蔥樣品共有的73個化學成分變量進行SPSS Pearson相關性及聚類分析(圖3)。云南洋蔥樣品G、A、B、H之間化學成分含量具有相關性，相關性大于0.94；黑龍江洋蔥樣品N、Q、R、U、O、T化學成分含量具有獨立性，與其他洋蔥樣品之間相關性較低，相關性為0.39～1.00；云南洋蔥樣品I、K、E、F、C、J、D與黑龍江洋蔥樣品V、S、M、P、L、W之間化學成分含量具有相關性，相關性大于0.82，其中云南洋蔥樣品E、F、C、J、D相關性大于0.94。

從圖3可以看出，不同產地、不同批次的洋蔥樣品化學成分含量相關性差異不明顯，Pearson相關性及聚類分析不能直觀區分兩個產地洋蔥化學成分含量直接差異性。

圖3 洋蔥樣品Pearson相關性及聚類分析圖

2.5 主成分分析(PCA)

PCA分析通過線性變換降維處理，以較少的指標反映盡可能多的信息，并對具有代表性的主成分進行可視化[18]。所建模型累積解釋能力參數R2X=0.673>0.5，預測能力參數Q2=0.356<0.4，說明模型的擬合準確性差，不能夠較好充分反映數據信息，理論上R2和Q2數值大于0.4可接受，大于0.5較好，越接近1說明模型越好[19-20]。對23批樣品進行PCA分析，從PCA得分圖(圖4)可以直觀看出，每個點分布距離越遠表明差異性越大，黑龍江洋蔥中Q、P、O、T與其他樣品化學成分含量差異較大，與匹配矩陣分析結果相似。其他樣品中，兩個產地洋蔥樣品出現混雜情況，無法區分不同產地洋蔥化學成分含量差異性。表明用PCA構建模型未能將兩個產地的洋蔥化學成分含量進行有效區分。

圖4 洋蔥樣品PCA分析圖

2.6 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

為更好區分兩個產地間洋蔥，對獲取的UHPLC數據進行OPLS-DA多元統計分析。通過SIMCA14.1軟件建模OPLS-DA分析23批洋蔥中共有的73個化學成分變量，得到OPLS-DA散點圖(圖5)、VIP值圖(圖6)和S-plot圖(圖7)。OPLS-DA分析相比聚類分析、匹配矩陣和PCA分析能更有效區分兩個產地洋蔥中化學成分含量存在差異。圖5表明兩個產地洋蔥能夠較好區分，A、B、G樣品聚集，說明化學成分含量差異較小，K、M、L樣品聚集，說明化學成分含量差異較小，Q樣品較為特殊雖產自黑龍江但化學成分含量接近云南產洋蔥。VIP值可衡量各共有特征峰的表達模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助篩選質量差異標志物[21]。VIP>1表明該變量對所建模型的貢獻度高于平均水平[22]。VIP值越大對地域判別的差異性越顯著[23]。以VIP>1為篩選標準，篩選云南與黑龍江兩個產地洋蔥間化學成分含量差異的主要標志性物質。創建模型后自動擬合獲得累積解釋能力參數R2X=0.537>0.5，累積解釋能力參數R2Y=0.775>0.5，說明53.7%的變量可解釋77.5% 的組間差異。預測能力參數Q2=0.625>0.5，表示該模型穩定可靠，且能夠較好充分反映數據信息，具有較好的預測能力，能夠對兩個產地之間的化學成分含量進行正確分類，后續可用于化學成分含量之間的區分。

圖5 洋蔥樣品OPLS-DA分析圖

OPLS-DA模型置換檢驗permutation test，以確定模型是否過擬合。云南(圖6)與黑龍江(圖7)洋蔥的permutation test結果表明，兩組樣本結果在y軸上的截距小于0，模型沒有過擬合，具有較好的預測能力。

圖6 黑龍江洋蔥的OPLS-DA 置換檢驗圖

圖7 云南洋蔥的OPLS-DA置換檢驗圖

提取OPLS-DA模型中變量重要性投影(VIP)圖，見圖8，以VIP值>1.0為標準篩選化學成分差異標志物，在云南與黑龍江兩個產地洋蔥間共得到11個VIP值>1的共有峰，分別為60號峰(VIP值為4.75)、51號峰(VIP值為3.50)、35號峰(VIP值為1.90)、2號峰(VIP值為1.80)、71號峰(VIP值為1.60)、15號峰(VIP值為1.50)、53號峰(VIP值為1.40)、32號峰(VIP值為1.30)、66號峰(VIP值為1.20)、18號峰(VIP值為1.25)、12號峰(VIP值為1.10)。說明這些峰所代表的化學成分是造成云南與黑龍江產地洋蔥間化學成分含量差異的主要標志性物質[24]，但這些成分還有待于進一步鑒別。S-plot圖(圖9)，差異性化合物分布在S型曲線的上下端，右上端VIP值大于1的差異化合物色譜峰60，51，35，15，53，32，66，18，12，表示云南洋蔥中峰面積較大的化合物，云南洋蔥中這些化合物含量顯著高于黑龍江洋蔥。左下端VIP值大于1的差異化合物色譜峰2，71，表示云南洋蔥中峰面積較小的化合物，表示云南洋蔥中這些化合物含量顯著低于黑龍江洋蔥。

圖8 洋蔥樣品OPLS-DA VIP值圖

圖9 洋蔥樣品OPLS-DA S-plot圖

2.7 不同產地洋蔥中PGA1的含量分析

PGA1是洋蔥中特征活性成分，云南的10批洋蔥樣品PGA1平均含量為(197.21±63.22) mg/kg，黑龍江的13批洋蔥樣品PGA1平均含量為(121.37±43.12) mg/kg(圖10)。洋蔥中營養活性成分的累積受品種、種植環境、光照、生長溫度、土壤、施肥等因素的影響。從日照角度來看，洋蔥屬于長日照作物，在中國北方多種植長日照晚熟種，日照剛好擁有適宜于鱗莖膨大和抽薹開花所需的14 h以上長日照條件。而中國南方多種植短日照早熟品種，在高溫短日照條件利于長葉不利于形成蔥頭。從PGA1含量來看云南洋蔥中PGA1含量比黑龍江的洋蔥更高，可能短日照更能促進PGA1累積。從溫度對營養活性成分的累積來看，洋蔥適宜的生長溫度為13～26 ℃，種子和鱗莖可在3～5 ℃下發芽[25]。云南省紅河州建水縣年平均氣溫19 ℃[26]。黑龍江齊齊哈爾年平均氣溫3.9 ℃[27]。南方更適宜于洋蔥生長和PGA1累積，當然PGA1的累積可能受多種因素影響，還可能與土壤、施肥[28]等因素相關，張鄭等[29]研究表明環境條件及土壤理化性質不同，洋蔥品質差異較大。因此影響洋蔥中營養活性成分含量的具體因素有待于進一步研究。

圖10 不同產地洋蔥中PGA1含量測定結果

3 結論

洋蔥超高效液相色譜化學成分含量圖譜共標定73個共有色譜峰，通過OPLS-DA分析有效區分出云南和黑龍江兩個產地洋蔥的化學成分含量，結合VIP值>1、P<0.05 和S-plot分析共篩選出11種主要差異標志物。云南洋蔥前列腺素A1平均含量[(197.21±63.22) mg/kg]顯著高于黑龍江洋蔥[(121.37±43.12) mg/kg]，可能與種植環境等諸多因素有關。但試驗僅對不同產地中洋蔥化學成分含量與前列腺素A1含量的差異進行探索，今后可以通過擴大采樣范圍及采集品種的方法，調查生長環境和栽培技術，獲取更多的樣本信息進行分析，可為洋蔥后續的深入開發利用提供更多依據。