大別山栽培白及不同部位總酚含量測定及其抗氧化活性研究

何曉梅， 陳存武， 宋 程， 喬德亮， 陳 杰， 陳乃富*

(1.皖西學院生物與制藥工程學院,安徽 六安 237012；2.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

全世界白及屬植物現有9個種群，我國有4種，即白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.、華白及Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.、黃花白及BletillaochraceaSchltr.和小白及Bletillaformosana(Hayata)Schltr.[1]。白及是我國民間的傳統中藥，始載于《神農本草經》，為1995、2005年版《中國藥典》所收載，主要用于治療瘡瘍腫毒、外傷出血、肺傷咳血、吐血和手足皺裂等[2]。白及中含有多糖、酚類、黃酮類、氨基酸及少量的揮發油等[3]化學成分?，F代藥理研究表明，白及具有止血、保護胃黏膜、抗胃潰瘍、促進傷口愈合、抗病原微生物、抗腫瘤、調節免疫等[4-6]作用?？偡宇愇镔|主要具有強抗氧化作用，還有抗病毒、抗腫瘤、防輻射、預防心血管疾病、預防老年性病變等作用[7-8]。白及的藥理作用和白及中的酚類化合物有關，包括聯芐類化合物、二氫菲類化合物、聯菲類化合物以及其它菲類衍生物，如丁香樹脂酚、谷甾醇、沒食子酸等[9]。目前人們對于白及的研究主要集中于白及的種植、加工以及白及生物活性物質多糖的研究，對于白及總酚研究較少且缺乏系統性。由于人為的過度采挖，野生白及資源瀕臨滅絕，但近幾年人工栽培白及產量猛增，這就要求科研工作者加快對白及資源的研究。本研究以大別山栽培紫花三叉白及為實驗材料，優化總酚提取工藝，測定不同部位的總酚含量，并研究其抗氧化活性，為白及的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料

1.1 藥材 白及于2018年采挖于大別山地區霍山縣與兒街鎮真龍地村，經皖西學院中藥學教研室陳乃富教授鑒定為紫花三叉白及。進一步與中國食品藥品檢定研究院白及對照品(編號121262)進行對比，最終確定為2020年版《中國藥典》收錄的白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f。

1.2 試劑 沒食子酸、無水碳酸鈉、福林酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、維生素C、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等均為分析純。

1.3 儀器 HH-S4數顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)；UV-4802/4802S紫外可見分光光度計(龍尼柯儀器有限公司)；DGT-G電熱鼓風干燥箱(合肥華德利科學器材有限公司)；FA2204N電子分析天平(上海箐海儀器有限公司)；DXF-20C密封型粉碎機(1 000×g，西安寶正實業有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；GL21M高速冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥材處理 新鮮植株采后洗凈，塊莖于沸水煮至無白心后切成片，須根、莖、葉切成段，50 ℃干燥，粉碎，過60目篩，常溫保藏。

2.2 檢測波長確定 參照文獻[10-11]，分別制備塊莖總酚供試品溶液、沒食子酸對照品溶液(0.05 mg/mL)，加入Folin-酚試劑2.0 mL，黑暗中放置10 min后加入5.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液，加水至10.0 mL，50 ℃水浴20 min，以雙蒸水為對照確定最大吸收波長。

2.3 單因素試驗 以塊莖總酚含量為評價指標，乙醇體積分數、液料比、提取溫度、提取時間和提取次數為影響因素。

2.4 正交試驗 根據單因素試驗結果設計L9(34)正交試驗。

2.5 總酚含量測定 取須根、塊莖、莖、葉各3份，每份1.000 g，在80 ℃下用40 mL 60%乙醇回流提取2 h，過濾，收集濾液，濾渣重復上述操作2次，合并濾液，測定總酚含量。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 白及總酚清除DPPH·能力 參照白子凡、黃申等[12-13]報道改進，以維生素C為對照品，配制0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL總酚溶液，各取1.0 mL，加入4.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后避光反應30 min，以無水乙醇為參比，于517 nm波長處測定吸光度，重復3次，計算抑制率(I)，公式為I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0為4.0 mL DPPH乙醇溶液與1.0 mL蒸餾水混合后的吸光度，Ai為4.0 mL DPPH乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液混合后的吸光度，Bi為4.0 mL乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液混合后的吸光度。

2.6.2 白及總酚清除ABTS+·能力 參照高華山、趙康宏等[14-15]報道改進，以維生素C為對照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL總酚溶液，各取0.5 mL，加入4.5 mL 6 mmol/L ABTS+·工作液，混勻后避光反應30 min，以蒸餾水為參比，于734 nm波長處測定吸光度，重復3次，計算抑制率(I)，公式為I=[A0-(Ai-Bi)]/A0×100%，其中A0為4.5 mL ABTS+·工作液與0.5 mL蒸餾水混合后的吸光度，Ai為4.5 mL ABTS+·工作液與0.5 mL樣品溶液混合后的吸光度，Bi為4.5 mL蒸餾水與0.5 mL樣品溶液混合后的吸光度。

2.6.3 半抑制濃度(IC50)計算 根據抑制率(I)繪制一元回歸方程，計算樣品對DPPH·和ABTS+·的IC50[16]。

2.6.4 總還原力測定 采用普魯士藍法[17]。以維生素C為對照，配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL總酚溶液，各取2.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、2.5 mL 1%K3[Fe(CN)6]溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%TCA混勻，吸取2.5 mL，加2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，于700 nm波長處檢測吸光度。

3 結果

3.1 總酚測定波長 總酚類物質在堿性溶液中可以將福林酚溶液中的鎢酸鈉還原生成藍色化合物，該化合物在770 nm附近有最大吸收峰[18]。沒食子酸標準品溶液與白及塊莖總酚供試品溶液與福林酚溶液反應的光譜掃描圖表明，兩者最大吸收波長一致。

3.2 單因素試驗

3.2.1 乙醇體積分數 圖1顯示，隨著乙醇體積分數的升高，總酚含量先升高后下降，在70%后更明顯，這主要是因為總酚為多羥基化合物，具有較強的極性，乙醇體積分數升高會導致溶劑極性下降，從而總酚含量降低。因此，選取50%、60%、70%作為正交試驗考察范圍。

圖1 乙醇體積分數對白及總酚含量的影響

3.2.2 液料比 圖2顯示，隨著液料比增加，總酚含量緩慢上升；隨著溶劑用量進一步升高，增大了溶質和溶劑的接觸面積，細胞內外溶質的濃度差增大，有利于總酚溶出，當液料比高于35∶1時呈下降趨勢，可能是其他物質的溶出也在變多，形成了競爭抑制。因此，選取30∶1、35∶1、40∶1作為正交試驗考察范圍。

圖2 液料比對白及總酚含量的影響

3.2.3 提取溫度 圖3顯示，隨著提取溫度升高，總酚含量呈現先上升后下降的趨勢，在70 ℃時最高；隨著溫度進一步升高，分子熱運動不斷增強，總酚溶出量增加，但高于70 ℃時反而降低，可能是總酚被氧化所致。因此，選取60、70、80 ℃作為正交試驗考察范圍。

圖3 提取溫度對白及總酚含量的影響

3.2.4 提取時間 圖4顯示，隨著提取時間延長，總酚含量先上升后下降，其原因可能是該成分在溶劑中部分被氧化，同時一些雜質也溶于溶劑中所致。因此，選取1、1.5、2 h作為正交試驗考察范圍。

圖4 提取時間對白及總酚含量的影響

3.2.5 提取次數 圖5顯示，提取1次后即可得到總含量的80%以上的總酚，綜合考慮時間和成本，確定提取次數為1次。

3.3 正交試驗 結果、方差分析表分別見表1～2。由此可知，各因素影響程度依次為提取溫度>乙醇體積分數>提取時間>液料比，但對總酚含量影響都不顯著(P>0.05)；最優工藝為A2B3C3D3，即乙醇體積分數60%，液料比40∶1，提取溫度80 ℃，提取時間2 h。在此條件下進行3批驗證試驗，測得總酚含量為2 788 μg/g。

圖5 提取次數對白及總酚含量的影響

表1 試驗設計與結果

表2 方差分析

3.4 總酚含量測定 表3顯示，不同部位總酚含量依次為葉>須根>莖>塊莖。

表3 白及不同部位總酚含量測定結果

3.5 抗氧化活性研究

3.5.1 DPPH·清除能力 圖6、表4顯示，莖、葉、塊莖、須根中總酚都具有清除DPPH·能力，并呈劑量依賴性；IC50依次減小，即抗氧化活性依次增強，并低于或接近相同質量濃度維生素C。

圖6 白及總酚清除DPPH·能力

表4 白及不同部位總酚抗氧化活性比較(DPPH·法)

3.5.2 ABTS+·清除能力 圖7、表5顯示，莖、葉、塊莖、須根中總酚對ABTS+·都具有清除能力，并呈劑量依賴性；在質量濃度低于60 μg/mL時，須根IC50最低、葉次之、莖最高，即抗氧化活性依次為須根>葉>塊莖>莖，而為60 μg/mL時抗氧化活性依次為須根>塊莖>維生素C>葉>莖。

圖7 白及總酚清除ABTS+·能力

表5 白及不同部位總酚抗氧化活性比較(ABTS+·法)

3.5.3 總酚還原能力 圖8顯示，隨著莖、葉、塊莖、須根總酚質量濃度增加，吸光度逐漸增大，表明其還原能力(即抗氧化活性)逐漸增強，在相同質量濃度下，抗氧化活性依次為須根>維生素C>塊莖>葉>莖。

圖8 白及總酚還原能力

4 討論

白及作為一味傳統的中藥，由于人為的過度采挖和天然生境的破壞，野生白及資源急劇減少，瀕臨滅絕。本實驗以紫花三叉白及為材料，測定白及須根、塊莖、莖和葉中的總酚含量。通過單因素和正交實驗法優化了白及總酚最優提取條件為乙醇體積分數60%，液料比40∶1，提取溫度80 ℃，提取時間2 h，提取1次，測得白及須根總酚含量為(1.34±0.023)%，白及塊莖總酚含量為(0.35±0.015)%，白及莖總酚含量為(0.86±0.021)%，白及葉總酚含量為(3.22±0.031)%。結果表明，白及不同部位總酚含量依次為葉>須根>莖>塊莖。

酚類物質是植物中廣泛存在的抗氧化活性成分。本實驗采用DPPH法、ABTS法和普魯士藍法測定白及須根、塊莖、葉和莖的總酚都具有較強的抗氧化活性，且同濃度的白及須根總酚抗氧化活性優于塊莖、葉和莖。由于總酚是酚類化合物的總稱，同一濃度下酚類化合物不同組成在一定程度上影響總酚的生物活性。另外，白及不同部位可能存在具有較強的抗氧化活性未知成分，從而影響其抗氧化活性。目前《中國藥典》只收載白及塊莖，其須根、葉和莖則棄之不用。本研究結果為深度開發和利用白及資源，提高白及的附加值及其天然抗氧化活性物質研究提供科學基礎。