甘草毛狀根總黃酮提取條件優化及3種甘草毛狀根提取液成分和活性比較

曲紅盼 郝晴 韓雅蕾 劉蕾 成志偉

摘要：以烏拉爾甘草毛狀根為材料、總黃酮含量為指標，采用超聲法提取，分別以提取溶劑、料液比、超聲溫度、超聲時間為單因素，確定影響提取率的因素與水平，通過正交法優化，確定提取工藝的最佳條件。采用比色法測定比較3種甘草毛狀根中總黃酮的含量，通過高效液相色譜法分析比較3種甘草毛狀根中甘草苷、異甘草苷和光甘草定的含量。通過紅細胞溶血和雞胚絨毛尿囊膜試驗、DPPH自由基與ABTS自由基清除試驗和酪氨酸酶酶活抑制試驗，分別比較3種甘草（烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草）毛狀根提取液的刺激性、體外抗氧化和抑制酪氨酸酶酶活的能力。結果表明，在溶劑為75%丙二醇、料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃、超聲時間40 min條件下，烏拉爾甘草毛狀根總黃酮提取率最高，為1.25%。在3種甘草毛狀根中，烏拉爾甘草毛狀根中異甘草苷的含量最高，光果甘草毛狀根中總黃酮、甘草苷和光甘草定的含量均最高;3種甘草毛狀根提取液（濃度≤625 mg/L）對紅細胞及雞胚絨毛尿囊膜均無刺激性;3種甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）依次為1 100、570、540 mg/L，清除ABTS自由基的IC50依次為740、230、590 mg/L;3種甘草毛狀根提取液（濃度為625 mg/L）對酪氨酸酶活性抑制率依次為（49.5±2.3）%、（76.6±3.5）%、（17.95±4.5）%。在3種甘草毛狀根中提取液光果甘草的抗氧化及美白護膚活性最好。

關鍵詞：甘草;毛狀根;總黃酮;刺激性;抗氧化;酪氨酸酶

中圖分類號：R284 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0155-08

收稿日期：2021-10-07

基金項目：北京市教育委員會科技面上項目（編號：SQKM201710011010）。

作者簡介：曲紅盼（1994—），女，河北武邑人，碩士研究生，主要從事甘草中次生代謝物的合成機制研究。E-mail：13146918700@163.com。

通信作者：成志偉，博士，副教授，主要從事植物次生代謝物的合成機制研究。E-mail：chengzhiwei@btbu.edu.cn。

甘草是豆科甘草屬多年生草本植物，收錄于2020年版《中國藥典》（簡稱《藥典》）的有3個品種：烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草[1]。甘草中的活性成分主要有黃酮類、三萜類及多酚類等化合物[2]，它們被廣泛應用在工業產品中。在醫藥領域，甘草苷具有抗抑郁和降血糖等作用[3]，異甘草苷具有促進血管生成的作用[4]，光甘草定具有抗腫瘤轉移的作用[5]等;在煙草行業中，甘草根提取液可改善煙草的吸味與口感[6-7];在日化領域，甘草提取液及其化合物（光甘草定、甘草酸二鉀和甘草亭酸等）[8]具有抑制酪氨酸酶活性[9]、抗菌[10]、抗炎[11]和抗氧化[11]等功效。隨著工業（醫藥、食品和日化）生產對甘草原料需求的增長，野生甘草的過度采挖及其生長環境的惡化，導致野生甘草資源日漸枯竭，已被列為國家Ⅱ級瀕危珍稀物種（http：//www.iplant.cn/rep/protlist）。通過發根農桿菌誘導甘草產生毛狀根[12]是一種解決工業生產對甘草資源需求的有效途徑。

目前，對甘草毛狀根的研究主要集中在比較其與甘草藥材[13-15]中次生代謝物[12，16-17]含量差異等。但是，系統性地比較3種不同品種甘草（烏拉爾甘草、光果甘草和脹果甘草）毛狀根的成分差異，以及甘草毛狀根提取液對皮膚的潛在護膚活性還未見報道。因此，本研究采用單因素和正交試驗對超聲法提取甘草毛狀根中總黃酮條件進行優化，比較3種甘草毛狀根提取液中總黃酮及黃酮類化合物（甘草苷、異甘草苷和光甘草定）的含量差異，并對甘草毛狀根提取液的刺激性、抗氧化和抑制酪氨酶酶活能力進行比較，以期為甘草毛狀根將來作為原料在工業產品中的運用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

甘草毛狀根材料由筆者所在實驗室誘導構建，材料的誘導和品種背景鑒定參考Khazaei等的方法[18-19]。液態條件下培養收獲的甘草毛狀根材料經真空冷凍干燥后，研磨成粉，100目過篩備用。

烏拉爾甘草與光果甘草藥材購置于河北省安國中藥材專業市場，甘草品種背景鑒定參考楊瑞等的方法[19]，甘草藥材研磨成粉，100目過篩備用。

甘草苷、異甘草苷、光甘草定，色譜純，上海源葉生物科技有限公司;乙腈，色譜純，天津市永大化學試劑有限公司生產;蕓香苷、2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦肼基自由基（DPPH自由基）、維生素C，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司生產;亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉，分析純，北京化工廠生產;丙二醇、過硫酸鉀，分析純，上海麥克林生化科技有限公司;奎諾二甲基丙烯酸酯（trolox）、2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酪氨酸酶、L-酪氨酸，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產。

U3000高效液相色譜，賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產;Infinite M200 Pro多功能酶標儀，瑞士Tecan公司;CK2000高通量組織研磨儀，北京托摩根生物科技有限公司生產;LGJ-18型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司生產;KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司生產;QB-206 多用途旋轉搖床，其林貝爾儀器制造有限公司生產;Centrifuge 5424R冷凍離心機，德國Eppendorf生產。

1.2 試驗方法

2020年5月至2021年9月，于北京工商大學北京市植物資源研究開發重點實驗室開展相關試驗。

1.2.1 超聲法提取率的影響因素及其水平的確定

取1 g烏拉爾甘草毛狀根粉末，在不同提取溶劑、料液比、超聲溫度和超聲時間下進行提取，10 000 g離心10 min，取上清溶液用于總黃酮提取率的測定。根據上述單因素試驗結果，用正交試驗對其工藝參數進行進一步優化，以明確該提取方法的最佳技術參數。

1.2.2 成分測定

1.2.2.1 總黃酮含量的測定 采用Al（NO3）3-NaNO2法[20]測定甘草毛狀根總黃酮含量。精確量取0、25、50、100、150、200 μL蕓香苷標準溶液（1 mg/mL）于2 mL 離心管，加入5% NaNO2溶液 50 μL，混勻后靜置6 min;加入10% Al（NO3）3溶液 50 μL，混勻后靜置6 min;加入5% NaOH溶液 500 μL，混勻后靜置15 min;反應體系終體積用75%乙醇溶液定容至1 mL。在510 nm波長下測定溶液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，蕓香苷質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

取3種甘草毛狀根提取液，按照上述步驟操作，在510 nm波長下測定溶液的吸光度。根據標準曲線（回歸方程為：y=0.007 6x+0.037 3，r2=0.998 9，表明線性關系良好，線性范圍25～200 mg/L）分別計算出3種甘草毛狀根提取液中的總黃酮含量。

1.2.2.2 甘草苷、異甘草苷和光甘草定含量的測定 甘草苷、異甘草苷和光甘草定的HPLC檢測條件參考周逸芝等的方法[21]。色譜柱：Thermo Hypersil-Keystone C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈（M）-0.05%磷酸溶液（N），流動相比例0～15 min，20%～25% M;15～30 min，25%～40% M;30～40 min，40%～60% M;40～41 min，65%～95% M;檢測波長為276 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。根據標準曲線（甘草苷回歸方程為：y=1.914 4x+4.932 9，r2=0.999 8，表明線性關系良好，線性范圍 2～20 mg/L;異甘草苷回歸方程為：y=1.004 9x-0.140 4，r2=0.999 7，表明線性關系良好，線性范圍1～12 mg/L;光甘草定回歸方程為：y=0.351 5x-0.137 5，r2=0.998 7，表明線性關系良好，線性范圍3～50 mg/L;）分別計算出3種甘草毛狀根提取液中的甘草苷、異甘草苷和光甘草定含量。

1.2.3 刺激性評價

1.2.3.1 紅細胞溶血試驗 紅細胞（RBC）溶血試驗可替代德萊塞測試（Draize test）眼刺激性試驗，用于檢測化妝品原料的眼刺激性[22]。檢測RBC的完整性樣品a1：用PBS（pH值=7.4）配制系列梯度的SDS溶液（0～80 mg/L）;檢測對RBC刺激性的樣品a2：用PBS（pH值=7.4）將待測樣品（75%丙二醇和甘草毛狀根提取液）稀釋系列濃度;陽性對照樣品b：蒸餾水（溶血率100%）;陰性對照樣品c：PBS（溶血率為0）。取上述樣品溶液750 μL和質量分數為2%的紅細胞懸液250 μL混勻，150 r/min搖床孵育1 h。在波長540 nm下測定溶液吸光度Da1、Da2、Db和Dc，紅細胞溶血率計算公式如下[23]：

溶血率=（Dai-Db）/（Db-Dc）×100%（i=）。（1）

1.2.3.2 雞胚絨毛尿囊膜試驗 參考行業標準SNT 2329—2009《化妝品眼刺激性 腐蝕性的雞胚絨毛尿囊膜試驗》[24]，采用反應時間法進行試驗：隨機選取5枚雞胚，依次將300 μL的3種甘草毛狀根提取液、0.9%氯化鈉溶液（陰性對照）和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液（陽性對照）滴加到雞胚絨毛尿囊膜表面，反應5 min，評估樣品刺激性。評分標準采用刺激評分（IS）法：sH（出血時間）即尿囊膜上觀察到開始發生出血的時間，s;sL（血管融解時間）即尿囊膜上觀察到開始發生血管融解的時間，s;sC（凝血時間）即尿囊膜上觀察到開始發生凝血的時間，s。刺激評分公式如下：

IS=[（301-sH）×5+（301-sL）×7+（301-sC）×9]/300。（2）

1.2.4 抗氧化能力評價

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力測試 樣品組A1：取500 μL甘草毛狀根提取液與500 μL DPPH無水乙醇溶液（2×10-4 mol/L）混合均勻;陰性對照A2：取500 μL的75%丙二醇與DPPH溶液混合均勻;樣品對照A3：取500 μL甘草毛狀根提取液與無水乙醇混合均勻。A1、A2和A3室溫避光反應30 min，在517 nm波長下測定溶液的吸光度D1、D2和D3[25]。對DPPH自由基的清除率的計算公式如下：

清除率=（D2+D3-D1）/A2 ×100%。（3）

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測試 量取ABTS儲備液（7.4 mmol/L）與K2S2O8儲備液（2.6 mmol/L）各3 mL，混合，避光靜置12 h，作為母液備用。用無水乙醇將母液稀釋，使其在波長734 nm下的吸光度值在0.7±0.02范圍內，即為ABTS自由基工作液。樣品組A4：取0.8 mL的ABTS自由基工作液和 0.2 mL 的甘草毛狀根提取液，混合均勻;陽性組A5：取 0.8 mL 的ABTS自由基工作液和0.2 mL的Trolox，混合均勻;空白組A0：取0.8 mL的ABTS自由基工作液和0.2 mL的無水乙醇，混合均勻。上述各組溶液室溫靜置10 min，在734 nm波長下測定吸光度值D4、D5和D0[26]。對ABTS自由基的清除率計算公式如下：

清除率=（D0-Di）/D0 ×100%（i=4，5）。（4）

1.2.5 美白功效評價

1.2.5.1 體外抑制酪氨酸酶活性試驗 參考行業標準T/SHRH 015—2018《化妝品-酪氨酸酶活性抑制實驗方法》[27]，對3種甘草毛狀根提取液的酪氨酶活性抑制率進行測定。采用固定反應時間法，按表1在10 mL離心管中依次加入L-酪氨酸（0.05%）、提取液和PBS緩沖液（pH值6.8），37 ℃孵育10 min;再依次加入酪氨酸酶（200 U/mL），混勻，37 ℃孵育30 min，在475 nm波長下測定吸光度[28]。酪氨酸酶活性抑制率計算公式如下：

抑制率=[1-（DC-DD）/（DA-DB）]×100%。（5）

2 結果與分析

2.1 超聲法提取率的影響因素及其水平的確定

選用研磨好的烏拉爾甘草毛狀根作為材料，確定超聲法中溶劑、料液比、超聲溫度和超聲時間各因素對總黃酮的提取率影響水平，優化總黃酮的提取條件。

2.1.1 溶劑對提取率的影響 提取溶劑對烏拉爾毛狀根中總黃酮提取率的影響見圖1-A。在料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃、超聲時間 30 min 的條件下，不同溶劑對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率差異顯著（P<0.05），從高到低依次為75%丙二醇>75%丁二醇>75%乙醇>水。因此，選擇75%丁二醇、75%乙醇和75%丙二醇3種溶劑用于后續正交試驗。

2.1.2 料液比對提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min的條件下，不同料液比對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-B）差異顯著（P<0.05），隨著溶劑的增加，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1 g ∶15 mL時，總黃酮提取率最高，為0.794%。因此，選擇1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL和 1 g ∶20 mL等3個料液比進行后續的正交試驗。

2.1.3 超聲溫度對提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、料液比1 g ∶15 mL、超聲時間30 min的條件下，不同超聲溫度對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-C）差異顯著（P<0.05），隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢，當超聲溫度為50 ℃時，總黃酮提取率最高，為0.905%。因此，選擇40、50、60 ℃等3個不同溫度進行后續正交試驗。

2.1.4 超聲時間對提取率的影響 在以75%丙二醇為溶劑、料液比1 g ∶15 mL、超聲溫度50 ℃的條件下，不同超聲時間對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率（圖1-D）差異顯著（P<0.05），隨著超聲時間的增加，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢，當超聲時間為30 min時，總黃酮提取率最高，為0.785%。因此，選擇20、30、40 min等3個超聲時間進行后續正交試驗。

2.1.5 正交優化 根據單因素試驗結果可知，因素A（提取溶劑）、B（料液比）、C（超聲溫度）、D（超聲時間）均會影響烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮的提取率，所以選擇以上4種因素進行正交試驗（表2），試驗結果見表3。不同因素對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的影響主次順序為C>D>B>A，即對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率影響最大的因素為超聲溫度，其次是超聲時間、料液比和提取溶劑。在此基礎上，對同一因素的3個水平進行比較，對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的影響依次為A2>A1>A3、B2>B3>B1、C2>C3>C1、D3>D2>D1。綜上所述，對烏拉爾甘草毛狀根中總黃酮提取率的最佳水平組合為A2B2C2D3，即在超聲提取中，溶劑為75%丙二醇，料液比1 g ∶15 mL，超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min。

按最佳提取條件進行驗證試驗，烏拉爾甘草毛狀根總黃酮提取率為1.25%，高于正交試驗中的9個組合試驗結果，表明試驗方案可行。

2.2 3種甘草毛狀根中成分含量的比較

2.2.1 總黃酮含量比較 按照“2.1.5”節正交優化條件，分別對3種甘草毛狀根中的總黃酮進行提取，比較提取液中總黃酮的含量，結果見圖2。烏拉爾甘草（簡稱“烏拉爾”）、光果甘草（簡稱“光果”）和脹果甘草（簡稱“脹果”）3種甘草毛狀根中的總黃酮含量依次為（12.48±1.26）、（42.03±1.47）、（30.32±1.67） mg/g?？傸S酮在3種甘草毛狀根中的含量存在顯著差異（P<0.05），其中光果中的總黃酮含量最高，分別比烏拉爾和脹果中的總黃酮含量高236.78%、38.62%。表明3種甘草毛狀根中總黃酮含量從高到低依次為光果>脹果>烏拉爾。

2.2.2 甘草苷、異甘草苷和光甘草定黃酮類成分含量比較 在比較甘草毛狀根總黃酮含量的基礎上，選取了具有代表性的甘草黃酮類成分進行比較，其中甘草苷[29]和異甘草苷[30]具有良好的抗氧化活性，光甘草定具有抑制酪氨酸酶活性調控黑色素生成的活性[31]。

采用HPLC分別測定它們在3種甘草毛狀根提取液中的含量，測定結果見圖3，甘草苷在3種甘草毛狀根中含量依次為（5.57±1.96）、（5.92±1.77）、（0.89±0.10） mg/g，其在3種甘草毛狀根中的含量存在顯著差異（P<0.05），光果中的甘草苷含量最高，分別比烏拉爾、脹果中甘草苷含量高6.28%、565.17%。異甘草苷在3個甘草毛狀根中含量依次為（3.8±0.07）、（0.71±0.09）、（0.73±0.03） mg/g，烏拉爾中的異甘草苷顯著高于其他甘草毛狀根，分別比光果、脹果中的異甘草苷含量高435.21%、420.55%。光甘草定在3種甘草毛狀根中含量依次為（0.49±0.02） mg/g、（13.71±0.86） mg/g、N.D.（未檢出），光甘草定在3種甘草毛狀根中的含量差異顯著（P<0.05），光果中的光甘草定含量最高，比烏拉爾中的光甘草定含量高 2 697.95%，脹果中光甘草定含量低于儀器檢出量。

表明3種甘草毛狀根中甘草苷含量依次表現為光果≈烏拉爾>脹果;異甘草苷含量依次表現為烏拉爾>光果≈脹果;光甘草定含量依次表現為光果>烏拉爾>脹果。

2.3 甘草毛狀根的刺激性

2.3.1 甘草毛狀根提取液對紅細胞的溶血率 首先采用紅細胞溶血試驗測定提取溶劑丙二醇的安全濃度，當丙二醇終濃度≤15%時，紅細胞溶血率低于5%，無刺激性（圖4）。因此，對甘草毛狀根提取液進行稀釋，即將甘草毛狀根提取液稀釋后使丙二醇的終濃度≤15%。

分別對濃度為2 000 mg/L（丙二醇濃度為15%）、1 250 mg/L（丙二醇濃度為9.38%）、625 mg/L（丙二醇濃度為4.69%）的甘草毛狀根提取液進行紅細胞溶血率測定，試驗結果見表4。當甘草毛狀根提取液濃度為2 000 mg/L時，烏拉爾、光果和脹果提取液對紅細胞的溶血率依次為（82.32±4.83）%、（90.49±2.43）%、（76.11±4.48）%，對紅細胞的溶血率均高于5%，有強刺激性;當甘草毛狀根提取液濃度為1 250 mg/L時，烏拉爾、光果、脹果提取液對紅細胞的溶血率依次為（3.58±1.21）%、（6.24±0.86）%、（7.95±1.52）%，光果、脹果對紅細胞的溶血率均高于5%，有刺激性;當甘草毛狀根提取液濃度為625 mg/L時，烏拉爾、光果、脹果提取液對紅細胞的溶血率依次為（2.19±1.05）%、（2.55±0.39）%、（3.95±1.19）%，對紅細胞的溶血率都低于5%，無刺激性。

2.3.2 甘草毛狀根提取液對雞胚絨毛尿囊膜的刺激性

在紅細胞溶血試驗結果的基礎上，評測甘草毛狀根提取液（濃度為625 mg/L）對雞胚絨毛尿囊膜的刺激性，試驗結果見圖5。供試溶液刺激雞胚尿囊膜血管5 min后，陽性對照（0.1 mol/L氫氧化鈉）出現嚴重溶血、重度凝血及重度血管溶解現象;而供試樣品（濃度為625 mg/L的3種甘草毛狀根提取液）與陰性對照（0.9%氯化鈉溶液）均無出血、凝血和血管融解現象。根據刺激評分IS數值，IS<1為無刺激性，1≤IS<5為輕刺激性，5≤IS<9為中度刺激性，IS≥10為強刺激性。通過計算，IS計算結果見表5，陰性對照的IS為0，表現為無刺激性;陽性對照的IS為18.59，表現為強刺激性，說明試驗結果符合預期是可接受的。3種甘草毛狀根提取液的IS值均小于1，說明濃度在625 mg/L，時甘草毛狀根提取液對雞胚絨毛尿囊膜均無刺激性。

2.4 甘草毛狀根提取液的抗氧化的能力

為了闡明甘草毛狀根提取液的抗氧化護膚功效，采用DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗對3種甘草毛狀根提取液的抗氧化能力進行體外評測。

2.4.1 甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的能力 3種甘草毛狀根提取液對DPPH自由基的清除能力結果見圖6，烏拉爾、光果、脹果提取液清除DPPH自由基的IC50依次為1 100、570、540 mg/L，3種甘草毛狀根提取液清除DPPH自由基的能力具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為脹果>光果>烏拉爾。與同提取條件制備的烏拉爾甘草藥材提取液相比較，3種甘草毛狀根提取液對DPPH自由基的清除能力均更強（IC50=1 310 mg/L）。

2.4.2 甘草毛狀根提取液清除ABTS自由基的能力 3種甘草毛狀根提取液對ABTS自由基的清除能力結果見圖7，烏拉爾、光果、脹果提取液對清除ABTS自由基的IC50依次為740、230、590 mg/L，3種甘草毛狀根提取液對清除ABTS自由基的能力具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為光果>脹果>烏拉爾。與同提取條件制備的烏拉爾甘草藥材提取液相比較，3種甘草毛狀根提取液對ABTS自由基的清除能力均更強（IC50=2 110 mg/L）。

2.5 甘草毛狀根提取液抑制酪氨酸酶的能力

根據“2.3”節篩選出的甘草毛狀根提取液安全濃度（625 mg/L）進行抑制酪氨酸酶能力的測定，試驗結果見圖8。烏拉爾、光果和脹果3種甘草毛狀根提取液對酪氨酸酶活性抑制率依次為（49.5±2.3）%、（76.6±3.5）%、（17.95±4.5）%。3種甘草毛狀根提取液對酪氨酸酶活性的抑制率具有顯著差異（P<0.05），從高到低依次為光果>烏拉爾>脹果。選用已有報道光甘草定含量最高的光果甘草藥材作為對照[32]，在相同提取條件下制備光果甘草藥材提取液，結果見圖8，光果提取液濃度為 625 mg/L 的抑制率為（76.6 ± 3.5）%對酪氨酸酶的抑制率顯著高于光果甘草藥材提取液濃度為 625 mg/L，抑制率為（44.4±5.9）%。表明3種甘草毛狀根提取液中光果對酪氨酸酶的抑制能力最強。

3 結論

采用單因素試驗和正交試驗，確定甘草毛狀根的最佳提取條件：提取溶劑為75%丙二醇，料液比為1 g ∶15 mL，超聲溫度為50 ℃，超聲時間為 30 min。3種甘草毛狀根中的總黃酮含量存在顯著差異（P<0.05），光果中總黃酮含量最高，脹果次之，烏拉爾中含量最低。其次，光果與烏拉爾中的甘草苷含量相當，均高于脹果;脹果與光果中的異甘草苷含量相當，均低于烏拉爾;光果中的光甘草定含量最顯著高于烏拉爾和脹果。

3種甘草毛狀根提取液濃度不高于625 mg/L時，提取液對紅細胞與雞胚絨毛尿囊膜均無刺激性。3種甘草毛狀根提取液對DPPH自由基的清除能力由強到弱依次為脹果、光果、烏拉爾;對ABTS自由基的清除能力由強到弱依次為光果、脹果、烏拉爾，光果和脹果對DPPH和ABTS自由基具有較好的清除能力。3種甘草毛狀根提取液抑制酪氨酸酶能力從高到低依次為光果、烏拉爾、脹果，光果對酪氨酸酶的抑制能力優于光果甘草藥材，說明光果提取液具有較好的美白護膚功效。

本研究結果顯示，3種甘草毛狀根提取液中光果在抗氧化及美白護膚活性上均優于烏拉爾和脹果。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2]Bao F，Bai H Y，Wu Z R，et al. Phenolic compounds from cultivated Glycyrrhiza uralensis and their PD-1/PD-L1 inhibitory activities[J]. Natural Product Research，2021，35（4）：562-569.

[3]劉 鵬，田俊生.甘草苷治療抑郁癥和糖尿病共病的網絡藥理學作用機制研究[J]. 天然產物研究與開發，2019，31（11）：1880-1886，1918.

[4]Liu Y Y，Wu J Q，Fan R Y，et al. Isoliquiritin promote angiogenesis by recruiting macrophages to improve the healing of zebrafish wounds[J]. Fish & Shellfish Immunology，2020，100：238-245.

[5]劉亮亮，陳 姬，張 波，等. 異甘草素與光甘草定抗腫瘤轉移作用比較[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，19（18）：245-250.

[6]卓漢強.一種含有植物精油的煙草加料香精配方：CN110527595A[P]. 2019-12-03.

[7]Palmatier M I，Smith A L，Odineal E M，et al. Nicotine self-administration with tobacco flavor additives in male rats[J]. Nicotine & Tobacco Research，2020，22（2）：224-231.

[8]曲紅盼，孔德承，成志偉.甘草次生代謝物在化妝品中的功效作用[J]. 中國化妝品，2020（8）：109-112.

[9]Chen J M，Yu X J，Huang Y F.Inhibitory mechanisms of glabridin on tyrosinase[J]. Spectrochimica Acta，2016，168：111-117.

[10]Tanaka Y，Kikuzaki H，Fukuda S，et al. Antibacterial compounds of licorice against upper airway respiratory tract pathogens[J]. Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2001，47（3）：270-273.

[11]Reigada I，Moliner C，Valero M S，et al. Antioxidant and antiaging effects of licorice on the Caenorhabditis elegans model[J]. Journal of Medicinal Food，2020，23（1）：72-78.

[12]楊世海，劉曉峰，沈 昕，等. 甘草Ri質粒轉化及不同理化因子對甘草毛狀根生長的影響[J]. 中國中藥雜志，2006，31（11）：875-878.

[13]杜 旻，向德軍，丁家宜，等. 甘草毛狀根培養系統的建立及化學成分分析[J]. 植物資源與環境學報，2001，10（1）：7-10.

[14]盧虹玉，劉 義，張海超，等. 甘草毛狀根中甘草總黃酮和甘草酸的檢測和分析[J]. 中國現代應用藥學，2010，27（1）：43-46.

[15]王裔惟，丁家宜，周倩耘，等. 光果甘草毛狀根培養過程中對活性氧清除能力和總黃酮含量的變化[J]. 植物資源與環境學報，2004，13（2）：6-9.

[16]盧虹玉，劉敬梅，張海超，等. 甘草毛狀根誘導培養及其黃酮含量檢測的研究[J]. 中國藥學雜志，2011，46（11）：814-818.

[17]姚慶收，陳向明，丁 斐，等. 甘草毛狀根遺傳轉化體系的建立及甘草酸和總黃酮含量的測定[J]. 中藥材，2018，41（9）：2035-2038.

[18]Khazaei A，Bahramnejad B，Mozafari A A，et al. Hairy root induction and Farnesiferol B production of endemic medicinal plant Ferula pseudalliacea[J]. 3 Biotech，2019，9（11）：407.

[19]楊 瑞，李文東，馬永生，等. 不同基原甘草的分子鑒定及市售甘草藥材的質量評價[J]. 藥學學報，2017，52（2）：318-326.

[20]苗永美，簡 興，汪 雁，等. 廣東石豆蘭不同溶劑提取物抗氧化及與總黃酮、總酚含量的關系[J]. 核農學報，2020，34（5）：1038-1046.

[21]周逸芝，劉訓紅，許 虎，等. 高效液相色譜法同時測定龍柴方及其組成藥甘草中甘草苷等5種指標成分的含量[J]. 中國藥學雜志，2013，48（2）：139-142.

[22]Okamoto Y，Ohkoshi K，Itagaki H，et al. Interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests for cosmetic ingredients.（3） Evaluation of the haemolysis test[J]. Toxicology in Vitro，1999，13（1）：115-124.

[23]王 東，馬金鳳，蔡明旭，等. 咖啡酰氨基酸乙酯的合成及其抗氧化活性[J]. 精細化工，2019，36（3）：494-498.

[24]國家質量監督檢驗檢疫總局.化妝品眼刺激性/腐蝕性的雞胚絨毛尿囊試驗：SN/T 2329—2009[S]. 北京：中國標準出版社，2009.

[25]賈冬英，曹冬冬，姚 開.荸薺皮提取物對DPPH自由基清除活性[J]. 天然產物研究與開發，2007，19（5）：745-747.

[26]Zou J，Huang Y X，Zhu L R，et al. Multi-wavelength spectrophotometric measurement of persulfates using 2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate） （ABTS） as indicator[J]. Spectrochimica Acta，2019，216：214-220.

[27]上海日用化學品行業協會. 化妝品-酪氨酸酶活性抑制實驗方法：T/SHRH 015—2018[S]. 上海：上海日用化學品行業協會，2018.

[28]Chaves O A，de Oliveira M C C，de Salles C M C，et al. In vitro tyrosinase，acetylcholinesterase，and HSA evaluation of dioxidovanadium （V） complexes：An experimental and theoretical approach[J].Journal of Inorganic Biochemistry，2019，200：110800.

[29]張麗宏，傅 云，廖 建，等. 甘草苷抑制UVB誘導HaCaT細胞凋亡的體外研究[J]. 中藥材，2017，40（11）：2672-2676.

[30]劉靖麗，權 彥，閆 浩，等. 基于DFT方法研究甘草中黃酮類化合物的抗氧化活性[J]. 當代化工，2020，49（10）：2163-2166，2170.

[31]Chen J M，Fang Q Y，Liu S Q，et al. Influences of several factors on the photolysis of glabridin under UV irradiation[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology，2017，339：12-18.

[32]張興琪，何敬愉，龔盛昭，等. 不同種類甘草成分及美白抗敏活性差異研究[J]. 日用化學工業，2021，51（7）：648-654.

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