煙草懸浮細胞在鎘脅迫下微絲形態與黏彈性變化的實時監測

劉藝璇，周鐵安,2，蘭雅琴，潘煒松,2,*

1. 湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128 2. 湖南省細胞力學與功能分析工程技術研究中心，湖南農業大學，長沙410128

近年來隨著我國工業化、城鎮化的快速推進，以及大量化肥和農藥的使用，加之污水灌溉、固體垃圾堆積及礦山開采冶煉等多種原因，導致重金屬特別是鎘污染日趨嚴重。鎘(cadmium, Cd)是環境中常見的重金屬元素，卻并非植物生長發育所需的必需元素。相反，當鎘累積到一定濃度時，植物的生長發育與生理活動會受到不同程度的影響。鎘對植物毒害的表現形式多種多樣[1]，游離鎘毒害使植物細胞骨架組裝紊亂[2]，超微結構表現異常[3]，葉綠體膜系統崩潰及類囊體結構退化[4]，組織完整性受損直至植株死亡[5]。水體中的鎘污染可導致水生植物氮代謝紊亂、氮素積累量下降[6]；游離鎘可推動水體中藻類群落演替[7]，使水體中浮游植物多樣性下降[8]。環境中的鎘還在水稻等植物中富集[9]，通過食物鏈進入人體，嚴重影響人類健康[10]。吸收入植物體內游離鎘，易與酶活性中心或蛋白質中的巰基結合，取代原本位于活性中心的其他二價金屬離子，使酶失去原有功能而失活變性，含有Zn、Mg和Fe的酶及光合磷酸化和呼吸電子傳遞鏈等生理活動都將受到抑制和破壞[11]。

植物的鎘逆境脅迫響應是多個代謝酶系統共同參與的整體調控反應[12]。鎘脅迫影響植物內生激素平衡，光合能力受損[13]；鎘脅迫煙草各項激素與膜質過氧化系統呈現低濃度下合成上升而高濃度時下降的特征[14]；過氧化酶系統對清除鎘毒害產生的活性氧具有重要作用[15]；植株整體可借助自身結構將所吸收的鎘鈍化并轉移，減少外環境中鎘毒害影響[16]；小麥根系在鎘脅迫下會改變氨基酸分泌物以減輕鎘危害[17]。植物防御素類似物蛋白調控基因CAL1可指導重金屬螯合物的合成，借此定向調控鎘在植株體中的積累過程[18]。細胞自噬過程中可能通過調節活性氧應答鎘脅迫[19]。植物的不同器官對鎘耐受程度有所區別，鎘在水稻不同部位累積為根>莖葉鞘>葉片[20]。鎘脅迫可能通過影響微管蛋白組裝而擾亂正常的染色體聚合與分配過程，并引發染色體畸變[21]。徐萍[22]發現在10-5mol·L-1鎘濃度下大蒜(AlliumsativumL.)根尖分裂間期微管會出現異常條紋、斷片和碎片化；分裂期微管會出現異常的微管凝結現象。目前對于植物吸收鎘機理的生物學研究大多集中在模式植物和常見農作物，對植物懸浮細胞在重金屬脅迫下力學參數變化的研究目前報道較少，我們對砷脅迫[23]和鎘脅迫下植物懸浮細胞的整體黏彈性與應力變化進行了初步的探索。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞：自行構建的增強型綠色熒光蛋白標記微絲[24](Lifeact-EGFP)的轉基因本氏煙草(Nicotianabenthamiana)(以下簡稱Lifeact-EGFP煙草)。在含有100 mg·L-1潮霉素(上海生工)的1/2 MS培養基平板上播種Lifeact-EGFP煙草，待種子萌芽未出真葉時，將萌芽轉移到BY-2培養基平板(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose+15 g·L-1Agar)上誘導愈傷組織，愈傷組織長出后再傳代3～4次，挑取色澤淡黃、質地松散的愈傷組織轉入BY-2細胞液體培養基(MS+3.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+30 g·L-1Sucrose)中擴增，每2周繼代一次，繼代時取少量細胞懸浮液鏡檢，直至得到離散程度較高的煙草懸浮細胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 鎘脅迫下煙草細胞微絲組裝程度變化實時監測

配制含鎘BY-2液體培養基：將CdCl2·2.5H2O晶體(國藥化學試劑有限公司，分析純)溶解于BY-2液體培養基中，配制10-2mol·L-1培養基母液，梯度稀釋至10-8mol·L-1。

靜電黏附界面修飾：與動物上皮細胞不同，植物懸浮細胞不具備貼壁效應，需要一個被修飾的界面使之形成基本同一的單層，以備后續觀察及監測。聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly dimethyl diallyl ammonium chloride, PDADMAC)是一種高分子強陽性電解質，工業生產中常用于捕捉帶負電的物質，此處用于植物細胞的靜電黏附修飾[25]。ITO小池為實驗室自制，底部為氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)鍍層玻片(珠海凱為光電股份有限公司)，小池最大容量1 000 μL，實驗中所用最大容量為500 μL。將ITO小池置于超凈臺內，紫外線照射滅菌不少于30 min。向ITO小池中加入200 μL經過濾滅菌的1%(V∶V)PDADMAC(Sigma-Aldrich，德國)溶液，遮光修飾不少于30 min，然后吸去多余的1% PDADMAC溶液，在超凈工作臺內以超純氮氣(長沙鑫湘氣體分析儀器經營部)吹干，使ITO表面形成一層靜電修飾膜。完成后以小塊封板膜密封池口保持內部潔凈無菌。

在ITO玻底小池中黏附細胞：將Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞過篩，提取100～500目之間即短軸徑在25～165 μm的懸浮細胞為待黏附的細胞，適當調整細胞濃度至每毫升500～1 000個。吸取過篩后細胞懸液500 μL加入到已修飾的ITO小池內，小塊透明封板膜密封池口，靜置遮光黏附約30 min，使懸浮細胞被靜電吸引至ITO鍍層表面。

脅迫實時觀察：將黏附細胞的ITO小池置于LumascopeTM720全自動活細胞成像系統(Etaluma，美國)的載物臺上，觀察細胞黏附情況，選取熒光信號鮮明、生長狀態良好的Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞視野。從小池中替換實驗組濃度的含鎘培養基250 μL，使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養基的1/2。迅速開啟延時拍攝程序，設置總時長5 h，間隔時長1 min。進行空白對照實時觀察時，沿用上述操作，將加入的含鎘培養基更換為無鎘的BY-2液體培養基。

基于圖像的熒光半定量分析：選取最具代表性的樣本，將脅迫實時觀察采集的圖像導入軟件ImageJ中。Image → Color → Split Channels將三色場分離，選取綠場灰度圖像；Image → Adjust → Threshold選擇Default計量模式，勾選Dark background識別暗底背景，設置量程為40～255；Analyze → Set Measurement，勾選Area、Mean gray value、Standard deviation、Limit to threshold這4項；最后Analyze → Measure，測得該綠場圖像整體的平均灰度強度值(mean gray value, Mean)與熒光區域面積值(Area)，并以公式：熒光強度總和(integrated density, IntDen) = 平均熒光強度(Mean)×熒光區域面積(Area)求得圖像的總體熒光強度值。每一脅迫觀察取樣31張，即每10 min一幀，取樣時長5 h。數據處理：使用Origin2018制作基于圖像的熒光半定量數據變化圖。

1.2.2 在QCM-922A多通道石英晶體微天平上實時監測鎘脅迫下煙草細胞黏彈性變化

該法所用Teflon?模塊池為實驗室自行設計，由Teflon?塊經機床切削制造，規格適配所用ITO鍍層9 MHz AT切石英晶體傳感器芯片 (仁路晶體) (以下簡稱傳感器芯片)。完成組裝的傳感器芯片-Teflon測試池，設計最大容量250 μL，實驗所用最大容量200 μL。測試池清潔消毒、黏附界面修飾方法同1.2.1。連通測試模塊與QCM-922A多通道石英晶體微天平(AMETEK Scientific Instruments Ltd.，美國)，在QCM調制界面上調整所測傳感器芯片相關參數，設置采樣時間為1 s，從空池開始實時監測。待所示曲線平穩后，向測試池加液口中加入BY-2液體培養基200 μL，繼續運行不少于6～8 h，觀察所顯示的圖形；運行至平穩后，從池中替換100 μL細胞懸浮液，即向測試池中加入細胞3 000～5 000個；繼續運行4～6 h，使懸浮細胞完全黏附在傳感器芯片表面；待運行至平穩，從小池中替換實驗組濃度的含鎘培養基100 μL，使小池中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養基的一半，繼續運行不少于5 h，停機并保存數據。進行空白對照組細胞黏彈性監測時，沿用上述操作，將替換的含鎘培養基變更為無鎘的BY-2液體培養基。

收集在石英晶體微天平上所測定數據，以公式CVI=ΔR/ΔF計算細胞黏彈性指數。式中：CVI即細胞黏彈性指數(cell viscoelastic index)[26]，ΔR為扣除基礎的電阻變化值，ΔF為扣除基礎的頻率變化值。完成計算后，在Origin2018上繪制CVI隨時間變化圖。

1.2.3 鎘脅迫下5 h內煙草懸浮細胞過氧化氫酶(CAT)活力測定

準備樣品：將煙草懸浮細胞經100目過篩，抽樣以血球計數板法計數并估算細胞濃度。將過篩的懸浮細胞等體積分裝至10 mL小離心管中，每管6 mL。

脅迫處理：1 000 r·min-1離心10 min使細胞沉淀在底部，將管中一半體積(3 mL)的培養基上清替換為含鎘離子BY-2液體培養基，使管中鎘離子濃度為所加入的含鎘培養基的一半，重懸細胞并開始計時；在開始計時后第1、2、3、4和5小時以去尖移液器吸取細胞懸浮液1 mL轉入1.5 mL離心管中，4 000 r·min-1離心棄去含鎘培養基后，等體積pH 7.4的PBS(北京索萊寶科技有限公司)溶液重懸細胞，迅速浸入液氮中速凍10 min。

測試取樣：將速凍的樣品在4 ℃環境中解凍后搖勻，3 000 r·min-1離心15 min，取上清為樣品，按過氧化酶微量樣品試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書操作制樣，用酶標儀(Multiskan skyhigh全波長酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司)測定。

數值統計：計算酶活力時，根據試劑盒說明書所述原理公式，根據實驗所需將組織濃度改為細胞濃度，定義酶活力單位為單位時間內每個細胞分解相應底物量(U·cell-1)，公式如下：

每樣本重復3次以校正偏差，完成計算后在Origin2018上繪制酶活力隨時間變化圖。

2 結果(Results)

2.1 鎘脅迫下煙草細胞微絲組裝程度變化實時監測

如圖1和圖4所示，Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在10-4～10-7mol·L-1鎘離子脅迫下，細胞具有的平均熒光強度、熒光區域面積與熒光強度總和均在脅迫觀察早期就開始下降；熒光信號的上述3個參數在10-4mol·L-1組別下降最快；在10-4～10-6mol·L-1組別，脅迫處理所用鎘離子濃度越大，細胞熒光信號下降的速度越快；在10-7mol·L-1組別，細胞熒光信號在脅迫開始早期下降得很快，但在后期下降速度很慢，并且直到觀察結束時，細胞內還有殘余的熒光信號。在10-8mol·L-1組別中，細胞具有的平均熒光強度、熒光區域面積與熒光強度總和在脅迫觀察早期呈現上升，熒光強度總和高于脅迫觀察開始時的值，并在高于初始值的范圍內保持近1 h，而后緩慢下降(圖2和圖4(e))。Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在無鎘離子脅迫時，微絲熒光強度緩慢下降(圖3和圖4(f))。

圖1 Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在10-4～10-7 mol·L-1鎘離子脅迫下的熒光實時觀察圖像注: (a) 10-4 mol·L-1，(b) 10-5 mol·L-1，(c) 10-6 mol·L-1，(d) 10-7 mol·L-1；從左至右分別為0 s、10 min、1 h和2 h時的細胞熒光強度實時變化，標尺為100 μm。Fig. 1 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-4～10-7 mol·L-1 cadmium ionNote: (a) 10-4 mol·L-1, (b) 10-5 mol·L-1, (c) 10-6 mol·L-1, (d) 10-7 mol·L-1; from left to right are the real-time changes of cells’ fluorescence intensity at 0 s, 10 min, 1 h and 2 h; bar is 100 μm.

圖2 Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在10-8 mol·L-1鎘離子脅迫下不同時間的熒光實時觀察圖像注：標尺為100 μm。Fig. 2 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells observed under the stress of 10-8 mol·L-1 cadmium ion at different timeNote: Bar is 100 μm.

圖3 Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在無鎘離子脅迫下不同時間的熒光實時觀察圖像注：標尺為100 μm。Fig. 3 Real-time fluorescence images of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells in the absence of cadmium ion (blank control) at different timeNote: Bar is 100 μm.

圖4 Lifeact-EGFP煙草懸浮細胞在不同濃度鎘離子脅迫下0～5 h的熒光強度總和(IntDen)實時變化注：(a) 10-4 mol·L-1；(b) 10-5 mol·L-1；(c) 10-6 mol·L-1；(d) 10-7 mol·L-1；(e) 10-8 mol·L-1；(f) 空白對照。Fig. 4 Real-time changes of the total fluorescence intensity (IntDen) of Lifeact-EGFP tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion for 0～5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

2.2 QCM-922A多通道石英晶體微天平上實時監測鎘脅迫下煙草細胞黏彈性變化

PDADMAC靜電修飾方法將煙草懸浮細胞黏附在傳感器芯片表面，通過QCM技術實時監測不同濃度鎘離子脅迫下煙草懸浮細胞的黏彈性變化。結果顯示，煙草懸浮細胞在10-4～10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下，細胞黏彈性在監測時間內呈現早期短暫上升，總體趨勢下降的變化(圖5(a)～(d))；在10-8mol·L-1鎘離子脅迫下，細胞黏彈性在監測時間內呈現先降后升的變化(圖5(e))；在無鎘離子的空白對照中，在更換培養基早期細胞黏彈性下降，后期保持不變(圖5(f))。

圖5 煙草懸浮細胞在不同濃度鎘離子脅迫下5 h內細胞黏彈性指數(CVI)變化注：(a)10-4 mol·L-1；(b)10-5 mol·L-1；(c)10-6 mol·L-1；(d)10-7 mol·L-1；(e)10-8 mol·L-1；(f)空白對照。Fig. 5 Changes of cell viscoelasticity index (CVI) of tobacco suspension cells under the stress of different concentrations of cadmium ion within 5 hNote: (a) 10-4 mol·L-1; (b) 10-5 mol·L-1; (c) 10-6 mol·L-1; (d) 10-7 mol·L-1; (e) 10-8 mol·L-1; (f) blank control.

2.3 鎘脅迫下5 h內煙草懸浮細胞過氧化氫酶活力測定

如圖6所示，所有實驗組別CAT酶活力均高于空白對照，并呈現出先升后降的整體變化趨勢。其中10-8mol·L-1組別的酶活力波動程度最小。

圖6 過氧化氫酶(CAT)在不同濃度梯度鎘離子脅迫下5 h內酶活力變化Fig. 6 Catalase (CAT) activity changes within 5 h under different concentration gradient of cadmium ion stress

3 討論(Discussion)

懸浮細胞本身具有分化程度低、代謝較旺盛、與相鄰細胞粘連程度低等特點，這使得我們能夠從細胞層次探索鎘逆境脅迫過程中植物細胞生理效應的變化。通過綠色熒光蛋白標記細胞微絲，本研究首先監測了不同濃度鎘離子脅迫下細胞微絲形態的變化。采用本課題組建立的植物細胞力學方法[23, 25-26]，本研究探索了鎘逆境脅迫對煙草懸浮細胞黏彈性指數的影響。我們認為鎘脅迫下植物細胞黏彈性變化的主要影響因素包括細胞壁的侵蝕與交聯程度變化、細胞內膜系統的崩解、細胞骨架的聚合和解聚等3個方面。

細胞壁是重金屬離子跨膜進入細胞質的第一道屏障結構。一方面，細胞壁對重金屬離子的固定、吸收和轉運過程起著重要的作用。另一方面，環境中的鎘離子在細胞壁兩側化學勢差的推動下，可從外至內逐漸侵蝕破壞細胞壁結構[27]，使細胞壁逐漸解體。細胞壁外側受侵蝕同時，胞內過氧化物累積促使酚類化合物和糖蛋白作用促進細胞壁交聯[28]；而在后期過氧化物積累形成的羥自由基[29]將切割細胞壁結構中糖鍵，促進細胞壁結構的解體。目前由于實驗條件的限制，本研究無法區分細胞壁黏彈性與細胞膜黏彈性變化。本文也從細胞力學角度首次發現了在10-4～10-7mol·L-1鎘離子濃度范圍脅迫下，細胞黏彈性短暫上升(細胞變硬)的現象。

在鎘侵蝕細胞壁同時，極少量的鎘離子通過細胞膜上鈣離子通道[30]進入細胞內，擾亂細胞內鈣調蛋白信號通路調控[31]的一系列原有生理活動，細胞內生理反應活動失控。游離鎘可誘發細胞膜電位去極化與超極化[32]。細胞內膜系統將從線粒體等高代謝率部位開始大量累積膜質過氧化物等自由基[33]，伴隨著細胞內膜結構系統上膜脂過氧化物的大量累積[34]，原有生物膜磷脂雙分子結構破壞并擴散為整個細胞內膜系統結構的解體[35]。細胞內膜系統的崩解是本研究監測到的CVI后續降低(細胞變軟)重要影響因素。

鎘逆境脅迫對細胞內微絲骨架的動態結構的影響呈現多態性。本研究觀測到了微絲骨架在鎘脅迫下普遍的解聚和在極低濃度鎘離子(10-8mol·L-1)脅迫下的早期聚合現象(圖1和圖2)。一種可能的解釋是極微量的胞內游離二價鎘取代原有鈣調蛋白介導信號通路，不可逆地促進肌動蛋白單體合成[36]。然而在本文所涉整個鎘逆境脅迫中，細胞內促進肌動蛋白合成與微絲組裝的因素，其效力遠低于破壞細胞肌動蛋白合成與微絲組裝的各種因素。在鎘離子脅迫下，胞內肌動蛋白單體結構異常及變性[37]；細胞內膜系統結構塌陷解體使與膜結構相連的微絲結構與膜系統一同解體[38]，表現為所觀測到的微絲標記熒光信號的不斷下降(圖1和圖4)。

本文從細胞力學角度為植物重金屬逆境脅迫生理生化的研究提供了新的視角。目前對植物細胞黏彈性監測的研究方法尚不完備，無法全面地解釋鎘逆境下植物細胞結構成分的詳細動態響應過程與生物力學參數變化，如需詳細探索重金屬脅迫對植物細胞結構穩定性的影響機制，尚待細胞力敏傳感技術、高分辨率成像工具與細胞內示蹤技術的進一步發展。