網絡藥理學和分子對接技術視角下柴胡對肝硬化的作用機制

孫志紅，于 琦，楊思遠，孫 焱

肝硬化是由某種病因激發的，其組織學特征為肝組織細胞彌漫性纖維化、假小葉和再生結節［1］。肝硬化在全球的發病率逐年上升，我國為肝硬化的高發地區。肝硬化臨床發病率高，危害大。除肝移植外，目前西醫并無治療肝硬化的切實辦法，常采用保肝、抗病毒等療法，但治療費用高昂，患者長期用藥易產生抗藥性，也會損傷患者的消化系統功能，加重其肝腎負擔，療效不佳［2-3］。中醫根據肝硬化的臨床癥狀將其納入“脅痛”“積聚”“黃疸”“鼓脹”的范疇［4］。中醫整體施治、審證求因，其活血散瘀、化樞散結、養陰解毒等法［5］在抗肝硬化治療中已取得一定療效［6］。

柴胡歸肝經，在治療肝病方面已有悠久歷史，柴胡類方也是《傷寒論》中的經典方劑。柴胡別稱山菜、地熏、茈胡，性微寒，味苦且辛［7］?！渡褶r本草經》云：“柴胡，可主心腹，去腸胃中結氣”［8］。已有研究表明柴胡有解除肝氣瘀滯、抗癌、抗纖維化的療效［9］。柴胡治療肝硬化在中醫領域已有應用，但目前國內研究多注重臨床觀察、病例展示，分子層面的理論支持較為欠缺，藥效物質基礎不清晰，治療機制不透明，因而柴胡治療肝硬化的方案臨床采用率較低，不利于中醫藥現代化健康發展。

網絡藥理學是根據“疾病-基因-靶點-藥物”間的作用關系，運用已有的基因庫、蛋白庫、疾病庫、藥物庫等數據庫的相關信息，結合從實驗中獲取的圖譜信息，使用專門的網絡軟件及相應的算法，具體清晰地揭示疾病與疾病、疾病表型與靶點蛋白、靶點蛋白與藥物、藥物與藥物間的互作方式，從網絡的范疇監控藥物對疾病的作用，從而摸索出有效且副作用小的多靶點新藥［10-11］。

分子對接是把Pubchem 等三維數據庫中的小分子依次置于靶標分子的活性位點，經過持續整合受體化合物的位置、構象、分子內部可旋轉鍵的二面角和受體的氨基酸殘基側鏈及骨架，探求受體小分子和靶標大分子相互作用的最優組合，并推斷其結合方式及親和力。分子對接可經過一系列函數計算篩選出最貼合的天然構象和受體親和力最好的配體，是模仿分子間作用的方法［12-13］。分子對接技術縮短了藥物開發周期，具有快速、精確度高的特點，在藥物研發領域大有作為，是先導化合物發掘和不斷優化的實用工具［14］。

本文運用網絡藥理學方法并結合分子對接技術從分子層面詳細探究柴胡治療肝硬化的作用機制，為進一步明確柴胡治療肝硬化的作用機制提供理論支持，以期為今后肝硬化的治療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源

在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）以“Herb name=chaihu”為檢索詞獲取柴胡的全部有效成分，設置藥物篩選標準口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，移除不合格成分，得到可藥用成分信息。

1.2 研究方法

網絡藥理學是系統且成熟的研究方法，可多靶點、多組分地將藥物靶點與疾病靶點相聯系，全面揭示藥物的作用機制。因而，本文運用網絡藥理學方法對柴胡治療肝硬化的成分及靶點進行分析歸納，通過系統的分析方法篩選出核心靶點，探究其治療肝硬化的作用機制。

1.2.1 篩選柴胡治療肝硬化的作用靶點

通過GeneCards 數據庫和DisGeNet 數據庫篩選出肝硬化關聯靶點，移除重疊靶點，得到肝硬化靶點信息?；赩enny 2.1.0 在線數據庫對肝硬化靶點和柴胡作用靶點取交集，獲得柴胡和肝硬化的共同靶點。

1.2.2 初步構建“化合物-靶點”網絡

將篩選出的有效成分及靶點數據導入Cytoscape 3.8.2 軟件，計算拓撲學參數并且構建“柴胡活性化合物-肝硬化靶點”關系網絡，然后進行可視化分析。

1.2.3 構建PPI 網絡，篩選核心靶點

將柴胡和肝硬化的共同靶點導入在線數據庫STRING 進行分析，生成蛋白相互作用網絡（Protein-protein Interaction Network，PPI）。利用Cytoscape 3.8.2 軟件中的CytoNCA 插件及其算法程序篩選出核心靶點，構建核心子網絡。

1.2.4 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

基于DAVID 在線數據庫對靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，使用R 程輯包（ggpubr、tidyr、stringr、ggplot2）對富集結果進行可視化分析，設置p＜0.05 為閾值，篩選符合條件的前20 位KEGG信號通路及GO 生物過程。

1.2.5 分子對接

對通過PPI 拓撲網絡篩選出的核心基因與其對應活性成分進行分子對接。在Pubchem 數據庫檢索出柴胡有效成分的二維結構，將其導入ChemBio 3D Ultra v14.0.0.117 軟件轉換為三維結構。使用蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank，PDB）查找核心靶蛋白，將其導入Pymol 2.4.1 軟件解除水分子及其原有配體。Pymol 2.4.1 是蛋白質可視化軟件，可以多角度展示蛋白質的不同形態，并對其進行操作。將柴胡有效成分的三維結構和去除水分子及配體的核心靶蛋白導入AutoDockTool 1.5.6 軟件進行分子對接。

2 結果與分析

2.1 柴胡的成分及相關靶點

通過檢索柴胡的有效成分發現，柴胡中有349種活性成分，將閾值調整為OB≥30%，DL≥0.18，共得到山柰酚（Kaempferol）、乙酸芳樟酯（Linoleyl acetate）、槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、茵陳黃酮（Areapillin）、黃芩苷（Baicalin）、異鼠李素（Isorhamnetin）等17 種成分，詳細信息見表1。這17 種成分分別作用于194 個靶點，其中部分靶點的Uniprot 編號、靶點名稱、基因名稱信息見表2。

表1 柴胡有效成分基本信息

續表1

表2 柴胡有效成分作用靶點（部分）

2.2 “柴胡活性化合物-肝硬化靶點”關系網絡構建

利用GeneCards 數據庫和DisGeNet數據庫查找肝硬化相關的編碼基因，獲得肝硬化相關靶點4 754 個?；赩enny 2.1.0 在線軟件繪制韋恩圖的功能，對柴胡的194 個藥物潛在靶點和肝硬化的4 754 個靶點取交集，得到159 個共同靶點，如圖1 所示。這159 個靶點既是肝硬化相關的靶點，也是柴胡治療肝硬化的作用靶點。將共同靶點和活性成分導入Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化分析，得到“肝硬化-柴胡活性化合物”網絡圖（圖2）。其中外圍黃色部分表示共同靶點，紅色部分表示藥物活性成分。

圖1 “肝硬化-柴胡靶點”韋恩圖

圖2 “肝硬化-柴胡活性化合物”網絡圖

2.3 PPI 網絡構建及核心靶點篩選

將159 個共同靶點導入STRING 在線數據庫中，設置物種為Homo Sapiens，得到PPI 網絡圖，展示了靶點間的相互作用關系。該網絡共有157 個節點（2 個靶點未被系統納入），2 963 條邊，見圖3。將PPI 網絡的TSV 文件導入Cytoscape 3.8.2，利用Cytoscape 3.8.2 中的CytoNCA 插件進行拓撲結構分析，根據插件算法在這157 個節點中篩選出連通性、緊密度、特征向量、中間度均靠前的15 個節點，利用這15 個節點構建出核心靶點網絡，過程見圖4。篩選出的15 個核心靶點既受柴胡活性化合物的調控，也與肝硬化的發病密切相關，詳細信息見表3。

表3 “柴胡治療肝硬化核心基因”詳細信息

圖3 “柴胡治療肝硬化靶點作用靶點”PPI 網絡

圖4 PPI 網絡中核心靶點篩選過程

2.4 GO 生物過程和KEGG 通路富集分析

將柴胡與肝硬化的交集基因上傳至DAVID 在線數據庫進行GO 分析，以p＜0.05、最小計數為3 且富集因子＞1.5 為閾值進行篩選，獲得GO 分析結果。利用R 程輯包（tidyr、stringr、ggpubr）將GO 分析結果可視化。依照p值從小到大的次序，選取前20 條GO 分析條目（圖5）。具體包括：生物進程（biological process，BP）——細胞表面受體信號通路、病毒過程、子宮內胚胎發育、細胞因子介導的信號通路、t 細胞受體信號通路、對病毒的防御反應、細胞外基質組織、細胞生長的正調控、細胞或亞細胞成分的運動、轉化生長因子β 受體信號通路；細胞組分（cellular components，CC）——黏著斑、神經元胞體、突觸、內質網腔、基底外側質膜；分子功能（molecular function，MF）——氧化還原酶活性、轉錄共激活因子活性、蛋白質二聚化活性、鐵離子結合、跨膜信號受體活性等。

圖5 “柴胡治療肝硬化作用靶點”GO 富集分析柱狀圖

經過柴胡治療肝硬化的靶點KEGG 通路富集分析共獲得130 條KEGG 通路，依照p值從小到大的次序篩選前20 條，主要為癌癥途徑、乙型肝炎、TNF 信號通路、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、美洲錐蟲病、非小細胞性肺癌、Hif-1 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、慢性髓細胞樣白血病、弓形體病、結腸直腸癌、小細胞肺癌、甲型H1N1 流感、丙型肝炎、Toll 樣受體信號通路、HTLV-I 感染、利什曼病、神經膠質瘤。利用R 程輯包（tidyr、ggplot2）對這些KEGG 通路進行分析及可視化（圖6）。

圖6 “柴胡治療肝硬化作用靶點”KEGG 富集分析氣泡圖

2.5 分子對接及結合能分析

對根據 PPI 拓撲網絡篩選出的核心基因（AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1）與其對應活性成分（乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素）進行分子對接，驗證柴胡活性成分與靶點的對應關系。一般認為，結合能小于-4.5 kcal/mol表示可以結合，結合能小于-6 kcal/mol 表示結合能力強［15］，其結果見表4。由表4 可見，乙酸芳樟酯與PTGS2、EGF 結合效果較好；山柰酚與CASP3、JUN、TNF 結合效果較好，與AKT1 可以結合，但結合效果有待進一步研究；槲皮素與MYC、EGFR、CCND1 結合效果較好，與MMP9可以結合，與TP53、IL6、VEGFA3 結合效果較差。另外，在分子對接過程中發現，靶點HIF1A、IL1B無法與柴胡的活性成分成功對接。靶點分子對接三維圖見圖7。

表4 柴胡活性成分與核心靶點分子對接結果

圖7 “柴胡活性成分與核心靶點”分子對接三維圖

3 討論

21 世紀以來，我國社會經濟高速發展，人們的生活結構發生巨變，人口老齡化進程加劇，國民疾病譜出現了很大的變化，心血管疾病、肝腎疾病、腫瘤等慢性復雜病非常突出，已經威脅到了我國人民的生命健康安全［16-17］。這些慢性病及其并發癥在發展過程中往往牽涉人體的多個器官、多個信號通路、多個靶點［18］，因此，西方醫學“一個靶點、一種疾病”［19］的藥物理念已經很難達到很好的療效。而網絡藥理學“多基因、多靶點、多通路”及中藥“多靶點、多路徑、多組分”聯合作用［20］，與這些慢性病的治療理念不謀而合。因此，探究中藥多組分、多靶點間的網絡關系，在闡述慢性病的發病機制和尋找治療靶標方面十分必要。

肝硬化是全世界肝病患者死亡的主要病因之一，許多急、慢性肝病最后均可能演化為肝硬化［21］。全世界肝硬化病亡人口從1990 到2013 年上漲40 余萬［22-23］。本文運用網絡藥理學方法構建了柴胡治療肝硬化的網絡圖譜，依次分析了其活性成分、調控靶點、生物進程和信號通路，解釋了柴胡在治療肝硬化中的作用。根據PPI 網絡篩選出了AKT1、TP53、IL6、TNF、VEGFA、JUN、IL1B、CASP3、HIF1A、MYC、EGFR、PTGS2、EGF、MMP9、CCND1 共15 個靶點度值較高的靶點。結合分子對接結果預測出柴胡治療肝硬化的關鍵靶點為PTGS2、EGF、CASP3、JUN、TNF、MYC、EGFR、CCND1。柴胡的有效成分可能是與這8 個關鍵靶點協同作用的。目前已有研究表明抑制PTGS2 可降低肝臟炎性損傷，PTGS2 可能是治療肝損傷的關鍵靶點［24-25］。EGF 促進細胞分裂，與組織的修復再生、癌癥的發生有緊密的聯系［26］，肝硬化的發生與其存在關聯［27］。肝細胞CASP3 在激活NASH 相關的細胞纖維化中有突出作用［28］。JUN 與肝癌的發生密切相關［29］，而在我國，將近85%的原發肝癌有肝硬化病理基礎［30］，可以推斷JUN 與肝硬化發病機制存在聯系［31］。有研究發現，降低血清中的TNF-α、IL-6、IL-8 水平后，肝纖維化的發展受到抑制［32］。MYC 在肝細胞增殖和肝臟腫瘤發生過程中起重要作用［33］。有研究表明，黏著斑激酶磷酸化后，可調控細胞周期蛋白從而促進肝星狀細胞增殖，形成肝纖維化。而基因CCND1 參與細胞周期蛋白的編碼，若可調控該基因則可調控細胞纖維化進程［34］，肝硬化發病率可得到有效控制。以上資料證明本文篩選出的關鍵靶點參與肝臟內的多個生物進程，GO 富集分析結果表明，柴胡有效成分的靶點涉及人體內的多個生物進程，參與人體內的多項機體活動，說明用柴胡治療肝硬化的過程是多靶點、多途徑協同作用的。

KEGG 富集結果顯示，柴胡治療肝硬化涉及多條信號通路，主要與癌癥途徑（51 個靶點參與）、乙型肝炎（35 個靶點參與）、TNF 信號通路（25 個靶點參與）聯系密切。乙型肝炎是我國肝硬化的主要病因，每年乙型肝炎發展所導致的肝硬化、肝癌等患者死亡數達26.3 萬［35］。研究結果表明參與乙型肝炎的靶點與參與肝硬化的靶點重合率較高，同時參與肝硬化的靶點與參與肝癌的靶點重合率也非常高，證實這兩條通路與肝硬化相關。TNF 信號通路在肝硬化的發病機制中發揮作用，有關研究表明位于肝竇內表面的吞噬細胞（KCs）源性TNF-α 的釋放增殖可以經TNFR/caspase8 通路誘導肝星狀細胞凋亡［36］，且肝星狀細胞活躍分化是肝纖維化產生的核心樞紐［37-38］，肝星狀細胞啟動機制和控制啟動的路徑研究成為治愈肝纖維化（早期肝硬化）的突破點［39］。

本文通過一系列分析發現，柴胡的有效活性成分有17 種，治療肝硬化的關鍵成分有乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素。目前有研究結果顯示乙酸芳樟酯可以調節肝臟中的線粒體功能［40］，而有實驗驗證保護肝中的線粒體就可以保護肝細胞，抑制肝硬化［41］。山奈酚作用于緊密連接蛋白，能夠有效治療小鼠的肝損傷［42］，而慢性肝損傷患者修復期會出現病理或生理性肝硬化［43］。槲皮素在體內和體外模型中均有抗纖維化活性，且在槲皮素的功能位置添加甲基可強化槲皮素的抗纖維化作用［44］。本文研究結果與上述相符，說明柴胡在治療肝硬化時具有多成分協作的特點。

4 結語

近年來，傳統醫藥在醫療領域逐漸發揮重大作用，許多疑難病癥通過中醫救治都有了很好的療效。對中藥作用機制細化可增強治療的可信性，有利于中醫藥更加深遠的發展。本文預見了柴胡治療肝硬化的有效活性成分、靶點、結合形式及相關通路，通過網絡藥理學給出了多成分、多靶點、多路徑的交互關聯結果，為研究柴胡的有效成分及肝硬化治療的機制提供了理論層面的依據。