鎘脅迫對不同植煙土壤硝化速率及N2O排放的影響

許琳 劉躍東 高加明 李方明 彭玉龍 劉明宏 林偉 徐茜 孫朝輝 張繼光

摘 ?要：為明確鎘（Cd）脅迫對不同植煙土壤的硝化速率及氧化亞氮（N2O）排放的影響，采用外源鎘添加試驗，設置兩個Cd濃度梯度（10和100 mg/kg），以探究Cd脅迫下中性（中性土1和2）和酸性（酸性土1和2）植煙土壤的凈硝化速率以及N2O排放特征。結果表明：1）隨培養時間增加，植煙土壤銨態氮含量逐漸減少，而硝態氮含量逐漸增加，且低Cd脅迫和高Cd脅迫均未顯著改變這一變化趨勢;2）植煙土壤凈硝化速率在培養前期（1～7 d）發生較大波動變化，Cd脅迫明顯增加了酸性土1在第1天的凈硝化速率;3）整體上各處理酸性土的N2O排放速率和累積排放量高于中性土，高Cd脅迫增加了酸性土1的N2O初始排放速率，培養結束后酸性土1的N2O累積排放量達355.42 μg/kg;4）各植煙土壤N2O排放速率和累積排放量與土壤pH和全氮含量極顯著負相關，而與有機質和銨態氮含量極顯著正相關。本研究結果表明植煙土壤的N2O排放受土壤酸堿性和氮底物的影響，酸性土的N2O累積排放量高于中性土，且高Cd脅迫增加其N2O排放量，后續可通過土壤酸化改良以達到N2O減排目的。

關鍵詞：植煙土壤;氧化亞氮;鎘脅迫;凈硝化速率

Abstract： In order to determine the effect of cadmium stress on nitrification rate and N2O emission traits of different tobacco planting soils， an incubation experiment of acid and neutral soils under two concentrations （10 and 100 mg/kg） of Cd addition were conducted. The results showed that， 1） The concentration of ammonium in acid and neutral tobacco soils decreased gradually with the extension of incubation time， while the concentration of nitrate increased throughout the whole incubation periods， and this tendency was not affected by low and high concentrations of Cd stress; 2） Soil net nitrification rate fluctuated strongly during the 1-7 d of incubation and Cd stress could stimulate net nitrification rate of acid soil type 1 on the 1st day; 3） The maximum of N2O emission rate and cumulative emission of acid soils were higher than that of neutral soils in general， and the high Cd stress could stimulate the initial N2O emission rate of acid soil 1， and the cumulative N2O emission of acid soil 1 was 355.42 μg/kg at the end of the incubation; 4） Soil pH and total nitrogen had significantly negative correlations with soil N2O emission rate and cumulative emission， but soil organic matter and ammonium had significantly positive correlations with soil N2O emission rate and the cumulative emission. These results indicated that N2O emission of tobacco planting soils was affected by soil pH and N substrate. The N2O cumulative emission of acid soils was much higher than neutral soils and they could be stimulated by the high Cd stress. So， the reduction of N2O emission could be achieved by improving soil acidification in the future.

Keywords： tobacco planting soil; nitrous oxide; cadmium stress; net nitrification rate

溫室氣體排放增加是導致全球氣溫上升的主要原因。在所有溫室氣體中，氧化亞氮（N2O）的增溫效應和增溫潛勢最大[1]。農田土壤是農業N2O的最大排放源[2]，農田土壤中的硝化和反硝化反應所釋放的N2O約占生物圈釋放到大氣中N2O總量的70%。煙草是我國重要的經濟作物之一[3]，近年來，不合理施肥與土壤管理及產地環境問題制約著煙草農業的可持續發展[4]，如植煙土壤長期大量施用氮肥導致土壤酸化、土壤板結和營養流失等問題[5]，同時也增加煙田生態系統N2O排放，加劇溫室效應[6]。

N2O產生途徑主要包括硝化和反硝化過程，主要受土壤理化性質、微生物和重金屬等因素的影響[7-8]。其中土壤有機碳增加可增強土壤反硝化作用，從而促進N2O排放[9]，土壤硝態氮含量增加也會促進酸性土壤N2O排放[10];在高銨態氮條件下，中性土壤的硝化作用由氨氧化細菌主導[11]，而在低銨態氮條件下，酸性土壤的硝化作用則由氨氧化古菌主導[12]。在一定pH范圍內，土壤N2O排放量會隨著pH增加而逐漸降低[13]，過量施氮導致農田土壤酸化會增加土壤N2O排放[14-15]。而在堿性土壤中，因反硝作用產物變化導致N2O排放降低[15]。此外，重金屬等環境脅迫，可以通過影響參與硝化/反硝化過程的細菌從而影響N2O排放[16]。有研究認為，重金屬對N2O反硝化還原過程中微生物的抑制作用強于生成作用，一定濃度范圍內可促進N2O排放[17-19]。Cd作為我國農田土壤最主要的無機污染物之一，前期研究發現[20]，不同程度Cd脅迫對土壤氮轉化過程的影響并不一致，低濃度（2～5 mg/kg）Cd脅迫可顯著促進氨氧化作用和硝化作用，而當Cd濃度達10～20 mg/kg時，對兩個過程具有抑制作用。因此，農田土壤N2O排放受不同土壤條件及Cd脅迫的重要影響。

當前，受地質背景、施肥管理及人類活動的影響，部分煙區存在土壤酸化及不同程度的Cd污染[21]，而Cd污染脅迫對不同植煙土壤的硝化作用和N2O排放的影響尚不清楚。因此，本研究通過外源Cd添加試驗，以不同酸堿性的植煙土壤（中性及酸性）為研究對象，探究Cd脅迫下不同植煙土壤的硝化作用、N2O排放特征及其影響因素，以期為植煙土壤N2O減排管理提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

供試土壤采集時間為2017年6月至10月，采自全國4個典型優質煙葉產區，分別為濰坊諸城、南平邵武、恩施宣恩和遵義湄潭，按照土壤酸堿屬性可劃分為2種中性土和2種酸性土（表1）。為了減少自然環境及耕作措施對土壤樣品的影響，土壤樣品采集均在晴天且未開展農藝活動時進行。每個產區均選擇當地同一區域的3塊代表性煙田，采用“S”型取樣法，取土深度為0～20 cm，每塊樣地取10～15點，并混合均勻作為一個混合土樣，每個土壤類型采集3個混合土樣（約50 kg）。將采集的土壤樣品立刻帶回實驗室，并剔除可見的石塊及動植物殘體，自然風干并過2 mm篩備用。供試土壤的基本理化性質如表1所示。

1.2 ?試驗設計

脅迫培養試驗在中國農業科學院煙草研究所進行，采用預培養后的植煙土壤開展試驗。鎘在土壤中具有較強的積累和遷移特征，我國部分區域農田土壤的鎘含量最高達25.7 mg/kg，而礦區土壤的最高量還要高一個數量級[22]，因此本試驗設置10 mg/kg與100 mg/kg兩個外源鎘濃度梯度，分別模擬兩個污染場景的情況，并描述為低濃度Cd脅迫處理與高濃度鎘脅迫處理。不同Cd濃度梯度通過向土壤中添加乙酸Cd溶液來實現，且每種土壤均設置對照處理（CK，0 mg/kg）。每個處理設置3個重復，在25 ℃恒溫條件下培養28 d，并在Cd添加后的第1、4、7、14、28 天等5個時間節點采集N2O氣體。在采集完氣體后，土壤樣品進行破壞性采樣處理，并密封保存于?40 ℃冰箱中用于土壤銨態氮和硝態氮含量測定。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?試驗操作 ?預培養：測定風干土樣的含水率，稱取相當于40 g干土的樣品加入錐形瓶中，用去離子水調節土壤含水量為最大田間持水量（WHC）的45%，在瓶口套上封口膜并固定（以減少水分的蒸發），同時在封口膜上扎幾個小孔使土壤與外界進行氣體交換。將錐形瓶放入25 ℃恒溫室進行預培養7 d，采用重量法定期加水以維持土壤含水量。

Cd脅迫培養試驗：預培養后按照試驗設計加入不同濃度的乙酸鎘溶液，并調節土壤含水量為最大田間持水量的60%，對土壤進行稱重記錄，將土壤樣品繼續放入25 ℃恒溫室中進行為期28 d的培養，培養期間添加去離子水保持土壤含水量為60% WHC，并定期進行氣體采樣。

氣體采集：取樣前24 h將瓶口塑料膜換成丁基橡膠塞進行密封，24 h后用帶有三通閥的注射器垂直插入丁基橡膠塞，來回推拉以使瓶內氣體混勻，抽取30 mL氣體垂直打入18 mL的真空頂空瓶，將收集好的氣體樣品于48 h內上機測定。

1.3.2 ?指標測定 ?土壤的基礎理化性質指標按鮑士旦方法測定[23]。土壤銨態氮和硝態氮含量采用2 mol/L的KCl溶液浸提，振蕩30 min后過濾，通過AA3流動注射分析儀（Skalar，Breda，荷蘭）分析測定[24]。N2O氣體采用氣相色譜儀（7890A，安捷倫公司）測定。

1.3.3 ?土壤凈硝化速率計算[25]

NR=（C1-C2）/（t1-t2）

NR為土壤凈硝化速率[mg/（kg·d）]，C1和C2分別為培養t2 d與t1 d時NO3--N含量（mg/kg）。

1.3.4 ?N2O累積排放量計算[10，26]

C樣品=C標準×PA樣品/PA標準

C樣品為N2O濃度（cm3/m3）;C標準為N2O標準氣體樣品濃度;PA標準為氣相色譜儀測定出的峰面積;PA樣品為氣體樣品的峰面積。

F為培養瓶內N2O排放速率[μg N/（kg·d）];Cs為N2O濃度（cm3/m3）;Ca為室外新鮮空氣中N2O濃度（空白培養瓶內N2O濃度）;ρ（N2O）為N2O在25 ℃時的密度，其值為1.12 kg/m3;V為培養瓶體積（mL）;m為培養瓶內相當于干土的土壤質量（g）;T為兩個相鄰采樣時間間隔（d）。

CE為N2O累積排放量（μg/kg）;i為第i次氣體采樣;F為N2O排放速率[μg N/（kg·d）];ti+1-ti為兩個相鄰采樣日期間隔（d）;n為累積排放量觀測時間內總的測定次數。

1.4 ?數據分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析（ANOVA），采用Duncan法進行多重比較，運用Origin9.0軟件繪圖，圖中數據均為平均值±標準誤。

2 ?結 ?果

2.1 ?Cd脅迫下不同植煙土壤銨態氮和硝態氮含量變化

如圖1所示，各處理土壤銨態氮含量隨培養時間呈快速下降并趨于平緩趨勢。在整個培養時段，在無脅迫CK下，酸性土1銨態氮含量顯著高于酸性土2和中性土1，除培養第1天及第4天外，其銨態氮與中性土2差異不顯著。培養結束時，各土壤銨態氮的減少量表現為：酸性土1（11.74 mg/kg）>酸性土2（10.51 mg/kg）>中性土1（8.05 mg/kg）>中性土2（4.25 mg/kg）（圖1 a）。在低Cd脅迫下，各土壤銨態氮的變化與CK處理趨勢一致，培養結束時，酸性土1的銨態氮減少量（12.84 mg/kg）分別是酸性土2和中性土1、2的1.11、1.61和2.13倍（圖1 b）。在高Cd脅迫下，酸性土1在培養后期（14～28 d）的銨態氮含量顯著高于其他3種土壤，且培養結束時，各土壤銨態氮減少量表現為：酸性土1（11.03 mg/kg）>酸性土2（10.10 mg/kg）>中性土1（6.12 mg/kg）>中性土2（5.04 mg/kg）（圖1 c）。

與銨態氮變化趨勢相反，在培養前期（1～7 d），各處理土壤的硝態氮含量呈快速增加，并在培養后期（14～28 d）趨于平緩（圖1 d-f）。在CK處理下，各土壤硝態氮含量整體呈現：中性土2>酸性土2>中性土1>酸性土1。在培養結束時，各土壤硝態氮

的增加量表現為：酸性土2（24.92 mg/kg）>中性土2（24.30 mg/kg）>中性土1（18.34 mg/kg）>酸性土1（11.00 mg/kg）（圖1 d）。低Cd脅迫下各土壤硝態氮的變化趨勢與CK處理一致（圖1 e）;而在高Cd脅迫下，與CK相比，中性土1、中性土2和酸性土2硝態氮增加量減少，而酸性土1增加量變大。

2.2 ?Cd脅迫下不同植煙土壤凈硝化速率變化

如圖2所示，各處理土壤的凈硝化速率隨培養時間總體呈波動降低趨勢，其中在培養前期（1～7 d）波動較大并在培養結束趨于一致。在CK處理中，整個培養階段2個中性土的凈硝化速率始終呈降低趨勢，在第1天達最大值，分別為1.78 mg/（kg·d）和2.19 mg/（kg·d），隨后降低;而2個酸性土的凈硝化速率均呈波動降低趨勢，其中酸性土1和2的凈硝化速率最大值分別出現在第1天[1.77 mg/（kg·d）]和第7天2.36 mg/（kg·d）]（圖2 a）。在低Cd脅迫下，中性土1和2分別在第1天和4天達最大值，分別是2.83 mg/（kg·d）和2.67 mg/（kg·d），酸性土1和2分別在第1天和第7天達到最大值，分別為3.31 mg/（kg·d）和3.20 mg/（kg·d）。與CK相比，低Cd脅迫后第1天明顯降低了中性土2的凈硝化速率，但增加了中性土1和2個酸性土的凈硝化速率，培養結束時4個土壤的凈硝化速率無顯著差異（圖2 a和b）。在高Cd脅迫下，中性土和酸性土的凈硝化速率變化趨勢與低Cd脅迫類似，與CK相比，高Cd脅迫后第1天，中性土1和酸性土2的凈硝化速率明顯降低，而中性土2和酸性土1的凈硝化速率明顯增加（圖2 a和c）。

2.3 ?Cd脅迫下不同植煙土壤N2O排放速率變化

由圖3可知，各處理土壤的N2O排放速率隨培養時間逐漸降低并趨于平緩，且酸性土的N2O排放速率整體高于中性土。低Cd脅迫下對N2O排放速率的影響與CK處理一致，各土壤的N2O排放速率在第1天達最大值，且4種土壤的N2O排放速率大小為：酸性土1>酸性土2>中性土1>中性土1（圖3 a～b）。在高Cd脅迫下，中性土1和2及酸性土1和2的N2O排放速率均在第1天達最大值，分別為7.04、5.12、53.05和10.97 μg/（kg·d），其中酸性土1在整個培養時段內的N2O排放速率顯著高于其他3種土壤。酸性土1在Cd脅迫后第1天的N2O排放速率顯著增加，分別是CK和低Cd脅迫處理的2.41和2.54倍。

2.4 ?Cd脅迫下不同植煙土壤N2O累積排放量變化

在培養時段內，4種土壤的N2O累積排放量隨著培養時間而逐漸增加，酸性土的N2O累積排放量始終高于中性土，且酸性土1的N2O累積排放量顯著高于其他3種土壤（圖4 a-c）。此外，高Cd脅迫促進酸性土1在各取樣時段的N2O累積排放量（53.05～355.42 μg/kg）增加，分別是同期CK和低Cd脅迫處理的1.16～2.43倍和1.17～2.54倍。

2.5 ?植煙土壤理化性質與凈硝化速率及N2O排放特征的相關性

如表2所示，土壤凈硝化速率僅與硝態氮含量呈顯著正相關，N2O排放速率和累積排放量與土壤pH和全氮含量呈極顯著負相關，與土壤硝態氮含量呈顯著負相關，而與土壤有機質和銨態氮含量均呈極顯著正相關。此外，N2O排放速率還與土壤的有效磷呈顯著正相關。

3 ?討 ?論

在農田土壤中，由反硝化作用產生的N2O占主要地位[27]，其中N2O還原酶對N2O的產生具有關鍵調控作用，該酶通常在中性環境下起作用并在酸性環境具有較強活性[28]。彭艷等[17]研究發現，酸性土壤中初始硝態氮含量增加會促進N2O排放，與該研究結果相似，本研究中酸性土的N2O排放速率在培養初期（1～7 d）明顯高于中性土，由于土壤pH

下降會抑制反硝化過程中N2O還原酶形成，進而促進N2O的積累[29]。此外，在酸性土壤條件下，真菌反硝化作用對N2O排放也產生重要促進作用[30-32]。許多研究已表明[10，13，33]，土壤硝態氮和銨態氮含量同樣影響土壤N2O排放。隨著土壤硝化作用進程，土壤銨態氮不斷向硝態氮轉化，硝態氮不斷累積。本研究中2個中性土的銨態氮含量處于較低水平，而土壤硝態氮含量始終處于較高水平，而且同期土壤N2O排放速率降低。KHALIQ等[33]研究表明，在一定pH范圍內（4.78～6.83）硝態氮含量增加后土壤N2O排放反而減少，這主要原因是在高硝態氮條件下，微生物不需要耗能產生N2O還原酶，進而促使N2O向N2轉變[13]。此外，本研究中發現酸性土1的N2O累積排放量最高，這可能與其較高的有機質含量有關，低pH可增加土壤有機碳的可利用性，進而增強土壤反硝化潛勢，導致N2O排放增加[34-35]。

重金屬脅迫也對土壤氮轉化及N2O排放具有重要影響，GUI等[20]研究表明，低濃度的Cd（2～5 mg/kg）可以顯著促進土壤氨氧化作用和硝化作用，使得土壤銨態氮含量和硝態氮含量增加，而Cd濃度達10～20 mg/kg時，則對這兩個過程具有明顯抑制作用。本研究結果顯示，低Cd脅迫（10 mg/kg）和高Cd脅迫（100 mg/kg）對培養初期不同土壤凈硝化速率的影響不一致，低Cd脅迫明顯降低了中性土2的初始凈硝化速率（第1 d），但增加了中性土1和兩種酸性土的凈硝化速率，而高Cd脅迫則明顯降低了中性土1和酸性土2的初始凈硝化速率，但增加了中性土2和酸性土1的凈硝化速率。目前，有關重金屬脅迫對土壤N2O排放的影響及機制尚未有一致結論。一般認為隨著重金屬濃度增加，反硝化功能基因nosZ表達受到抑制，需氧反硝化活動降低，導致硝酸鹽離子不斷積累和N2O排放速率增強[36]。與其他重金屬相比，Cd對土壤反硝化作用的抑制最強[37]。本研究中發現，高Cd脅迫更明顯促進酸性土N2O累積排放量增加，這是由于在酸性土壤環境中，土壤Cd的有效性增加[38]，從而加劇了Cd對N2O轉化過程的關鍵微生物的抑制作用，如抑制了N2O反硝化還原酶活性[9，18]，進而促進N2O在土壤中的積累。因此，后續針對一些具有Cd污染風險的酸性植煙土壤，可以通過施用生石灰、白云石粉及堿性肥料等酸化改良措施，來改善土壤酸堿性以降低Cd的有效性，從而起到減少土壤氮素損失及N2O減排的目的[14，39]。

4 ?結 ?論

隨Cd脅迫培養進程，4個植煙土壤的銨態氮含量減少，硝態氮含量逐漸增加，且低Cd和高Cd脅迫均未顯著改變這一變化趨勢。Cd脅迫對不同土壤培養初期（1～7 d）的硝化速率影響不一致，低Cd脅迫增加了2個酸性土和中性土1的凈硝化速率，而高Cd脅迫增加了酸性土1和中性土2的凈硝化速率。酸性土N2O排放潛力最大，高Cd脅迫促進酸性土N2O的累積排放量的增加，而且土壤N2O排放速率和累積排放量與土壤pH、全氮及硝態氮含量呈顯著負相關。因此，為減少植煙特別是酸化及Cd污染風險植煙的土壤N2O排放，進行土壤酸化改良是行之有效的重要措施。

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