腦蛋白水解物-Ⅰ對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

王圓明 倪欽帥 安康 于曦 朱琳

[摘要] 目的 探討腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用。方法 將32只C57小鼠隨機分為對照組、模型組、CH-Ⅰ低劑量組（3 mg/kg）和CH-Ⅰ高劑量組（6 mg/kg），模型組及CH-Ⅰ組小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，對照組小鼠頸背部皮下注射等量生理鹽水，注射3周后，給藥組小鼠腹腔注射相應劑量的CH-Ⅰ，對照組及模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續給藥5周后，進行老化度評分和曠場實驗。比色法檢測小鼠海馬組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。尼氏染色觀察小鼠海馬區神經元損傷。 結果 與對照組相比，模型組小鼠的老化度評分明顯增高（P<0.01），自主活動和探索行為減弱，海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低（P<0.01），MDA含量顯著增加（P<0.01），海馬CA1區神經元顯著損傷。經CH-Ⅰ治療后，可顯著降低衰老小鼠的老化度評分（P<0.05，P<0.01），提高小鼠的自主行為能力，提高海馬組織中SOD、GSH-Px活性（P<0.05，P<0.01），減少MDA含量（P<0.05，P<0.01），改善海馬組織CA1區神經元損傷。結論 CH-Ⅰ可以有效改善D-半乳糖模型小鼠的老化程度和自主行為，提高海馬組織的抗氧化能力，減少海馬神經元損傷。

[關鍵詞] 腦蛋白水解物-Ⅰ;D-半乳糖;衰老;C57小鼠;海馬

[中圖分類號] R965? ? ? ? ? [文獻標識碼] A&nbsp; ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）05-0030-04

[Abstract] Objective To investigate the anti-aging effect of cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ（CH-Ⅰ） on D-galactose-induced aging mice. Methods A total of 32 C57 mice were randomly divided into the control group， the model group， the CH-Ⅰ low-dose group （3 mg/kg） and the CH-Ⅰ high-dose group （6 mg/kg）. The model group and the two CH-Ⅰ groups were injected with 150 mg/kg D-galactose subcutaneously on the back of the neck. The control group were injected with the same amount of normal saline subcutaneously on the back of the neck. At 3 weeks after injection， the two CH-Ⅰ groups were injected intraperitoneally with the corresponding dose of CH-Ⅰ， and the control group and the model group were intraperitoneally injected with the same amount of normal saline. After continuous administration for 5 weeks， the aging degree scoring and open field experiment were performed. Colorimetric method was used to detect superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） activity and malonaldehyde （MDA） content in hippocampal tissue. Nissl staining method was used to observe neuronal damage in hippocampus. Results Compared with the control group， the aging score in the model group was significantly increased （P<0.01）， autonomous activities and exploratory behaviors were weakened， SOD and GSH-Px activities in hippocampus tissue were significantly reduced （P<0.01）， MDA content was significant increased（P<0.01）， and neurons in CA1 area of hippocampus were significantly damaged. CH-Ⅰ treatment significantly reduced aging score of aging mice （P<0.05，P<0.01）， improved autonomous activities， increased SOD and GSH-Px activities in hippocampus （P<0.05，P<0.01）， reduced MDA content （P<0.05，P<0.01）， and improved neuron damage in CA1 area of hippocampus. Conclusion CH-Ⅰ can effectively improve aging score and autonomous activities of D-galactose model mice， improve antioxidant capacity of hippocampal tissue， and reduce neuron damage of hippocampus.

[Key words] Cerebroprotein hydrolysate -Ⅰ; D-galactose; Aging; C57 mice; Hippocampus

衰老是大多數神經退行性疾病的主要危險因素，伴隨衰老常出現神經元損傷，特別是海馬區神經元損傷，并最終導致認知和自主行為障礙[1]。目前，對于衰老相關的神經退行性疾?。ㄈ缋夏晷园V呆和帕金森?。┥腥鄙偬匦У闹委煼椒?，這些疾病往往以不可逆轉的方式發展，并造成巨大的社會和經濟負擔[2]。衰老相關的神經元損傷涉及復雜的細胞和分子過程，包括氧化應激、炎性損傷、細胞凋亡、自噬等[3]。其中，氧化應激是海馬神經元衰老和行為能力下降的重要原因，在許多神經退行性疾病中，神經元內氧化應激升高是普遍存在的[4]。腦蛋白水解物-Ⅰ（cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ，CH-Ⅰ）是從豬腦組織中提取的低分子量神經肽類混合物，具有類神經營養因子的作用[5]。在體內，CH-Ⅰ已被證明可以促進神經發生，減輕神經炎癥，抑制自由基的形成，具有神經保護作用[6-7]。本課題組前期研究提示，CH-Ⅰ可以通過提高端粒酶活性而延緩D-半乳糖誘導PC12細胞的衰老損傷，減輕D-gal誘導小鼠海馬組織的衰老損傷[8]。但目前關于CH-Ⅰ對衰老小鼠氧化應激方面的影響尚不十分清楚。因此，本研究通過建立D-半乳糖誘導的衰老小鼠模型，觀察CH-Ⅰ抗小鼠衰老的作用和可能的機制。

1? 材料與方法

1.1? 材料來源

SPF級雄性8周齡C57/BL 6N小鼠32只，體重（21±3）g，購于北京維通利華實驗動物技術公司（SCXK2016-0006）。注射用腦蛋白水解物-Ⅰ（CH-Ⅰ）購于河北智同生物制藥公司（0190501-1，30 mg/支），D-半乳糖（D-galactose，D-gal）購于上海阿拉丁試劑公司（K1915124，純度≥99%），尼氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司。本實驗符合青島大學醫學部醫學倫理委員會審批（倫審批件號：WZLL26128）

1.2? 動物分組及處理

C57小鼠32只，飼養于SPF級動物室，自由飲食，適應性飼養1周后，將小鼠隨機分為對照組、模型組、CH-Ⅰ低劑量（CH-ⅠL）組、CH-Ⅰ高劑量（CH-ⅠH）組，每組各8只。除對照組外，各小鼠頸背部皮下注射150 mg/kg D-gal，對照組小鼠頸背部皮下注射等量生理鹽水，1次/d，持續8周。D-gal注射3周后，CH-Ⅰ低劑量組、高劑量組小鼠分別腹腔注射CH-Ⅰ3 mg/kg和6 mg/kg，對照組、模型組小鼠分別腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，持續5周。實驗過程嚴格遵守動物倫理學要求，動物全部存活，無死亡或脫失。

1.3? 老化度評分

給藥結束后，參考既往文獻的老化度評分標準，從反應性、皮毛光澤、皮毛粗糙程度、脫毛程度、皮膚潰瘍等指標，對小鼠進行客觀評分，積分越高表明老化度越高[9]。

1.4? 曠場實驗

給藥結束7 d后，使用曠場實驗檢測小鼠的自主活動和探索行為。每只小鼠放置于曠場中相同角落并面向墻壁，隨后小鼠自由活動5 min，錄像系統記錄小鼠的行為活動。每只小鼠實驗結束后擦拭干凈，避免留下氣味和污物。

1.5? 氧化應激指標檢測

每組隨機選取4只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經心臟灌注生理鹽水，完整取腦，冰上分離海馬組織，按照99：1比例加RIPA裂解液，勻漿器研磨，10 000 rpm離心5 min，取上清液（即蛋白提取液）置于EP管中。再次加入0.5～1.0倍的RIPA裂解液，重復離心1次，獲得蛋白提取液，BCA法測定蛋白濃度，-80℃保存。根據試劑盒的說明，使用比色法檢測SOD（四氮唑-8，WST-8法）、GSH-Px活性（還原型輔酶Ⅱ，NADPH法）和MDA（硫代巴比妥酸，TBA法））含量，分別以U/mg、U/mg和μM/mg表示。

1.6? 尼氏染色

曠場實驗結束后，每組隨機選取4只小鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，經心臟依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，完整取腦。腦組織常規梯度脫水、石蠟包埋，海馬區連續冠狀切片。切片常規脫蠟至水后，置于含焦油紫染液的染色缸中，于56℃溫箱中1 h，雙蒸水沖洗2 min。隨后將切片于尼氏分化液中分化1 min，常規脫水、透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察海馬CA1區染色情況，每張切片隨機選取5個不重疊的高倍（400×）視野觀察神經細胞尼氏小體的形態結構。

1.7? 統計學分析

應用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以（x±s）表示。多組間的數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD -t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? CH-Ⅰ對小鼠老化度評分的影響

老化度評分結果顯示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠的老化度評分明顯增高（P<0.01）。而給予CH-Ⅰ處理后，CH-ⅠL組和CH-ⅠH組的老化度評分較模型組小鼠均明顯降低（P<0.05，P<0.01），CH-ⅠL組、CH-ⅠH組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2? CH-Ⅰ對小鼠自主行為能力的影響

曠場實驗結果顯示，模型組小鼠在5 min內站立次數較對照組顯著減少（P<0.01），說明小鼠的自主活動能力減弱，且模型組小鼠在中央區的運動時間和距離縮短（P<0.01），小鼠的探索能力減弱。給予CH-Ⅰ處理后，CH-ⅠL組和CH-ⅠH組的小鼠站立次數較模型組明顯增加（P<0.05，P<0.01），在中央區的運動時間和距離明顯延長（P<0.05，P<0.01），CH-ⅠL組、CH-ⅠH組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明CH-Ⅰ可以提高小鼠的自主行為能力。見表2、圖1。

2.3? CH-Ⅰ對小鼠海馬組織中氧化應激損傷的影響

與對照組相比，衰老模型組小鼠的海馬組織中SOD和GSH-Px活性顯著下降（P<0.01），MDA含量顯著增加（P<0.01），說明衰老小鼠海馬組織的氧化應激損傷明顯增加。給予藥物治療后，CH-ⅠL組和CH-ⅠH組小鼠的海馬組織中SOD和GSH-Px活性均有升高（P<0.05，P<0.01），MDA含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01），而CH-ⅠL組、CH-ⅠH組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05），表明CH-Ⅰ能顯著提高小鼠海馬組織中抗氧化能力。見表3。

2.4? CH-Ⅰ對小鼠海馬CA1區神經元損傷的影響

對照組小鼠海馬CA1區的尼氏小體較多，排列整齊，廣泛分布;模型組小鼠海馬CA1區的尼氏小體明顯減少，排列紊亂，分布稀疏，說明海馬神經元出現損傷。給予CH-Ⅰ治療后，CH-ⅠL組和CH-ⅠH組小鼠的尼氏小體較模型組均有明顯增加，排列整齊，分布均勻，說明CH-Ⅰ可以改善衰老小鼠海馬區神經元的病理狀態。見封三圖6。

3? 討論

衰老是一個不可避免的復雜生物過程，主要是指生物結構的改變和各種因素導致的功能退化[10]。伴隨衰老常常會出現認知、自主行為能力的下降，而海馬組織與自主行為功能密切相關，在人類和動物中，海馬組織特別容易受到衰老的影響[11]。近年來，天然活性產物在衰老中的應用已成為一個熱門話題[12]。CH-Ⅰ是一種從豬腦組織中提取的神經肽類物質，用于治療血管性癡呆、創傷性腦損傷、腦卒中和阿爾茨海默病，具有一定的神經營養和神經保護作用[13-14]。但CH-Ⅰ對D-gal誘導的小鼠自主行為障礙和神經損傷的影響尚不明確。因此，本研究探討CH-Ⅰ對D-gal誘導的衰老模型小鼠的作用。

D-gal是乳糖的主要成分，在糖代謝中起到代謝作用。然而，D-gal的過度積累會導致代謝紊亂，最終導致衰老[15]。本研究結果表明，給予D-gal處理后，與對照組小鼠相比，模型組小鼠的反應性、皮毛光澤、脫毛程度、皮膚潰瘍等老化度評分明顯增加。此外，D-gal顯著降低小鼠的自主活動和探索行為能力。給予不同劑量的CH-Ⅰ（3、6 mg/kg）治療后，衰老小鼠的老化度評分明顯降低，自主活動和探索行為增加。尼氏小體可以反映神經元的損傷情況，當神經元受到損傷時，尼氏小體減少甚至消失，而在損傷恢復過程中，尼氏小體又重新增多[16]。本實驗利用尼氏染色觀察海馬組織中尼氏小體的分布情況，結果表明，模型小鼠海馬組織CA1區的尼氏小體明顯減少，而CH-Ⅰ可以增加衰老小鼠海馬組織的尼氏小體數量，說明CH-Ⅰ可以減輕海馬組織的神經元損傷。

氧化應激是導致細胞衰老的主要因素之一，既往研究表明，伴隨衰老，海馬神經元內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增加，抗氧化能力下降，最終導致神經元衰老和死亡[17]。氧化損傷程度可以通過評估抗氧化酶（如SOD、GSH-Px）的活性和氧化損傷相關產物（如MDA）的含量確定[18]。大量研究表明，D-gal代謝產生的ROS會在大腦中積累，通過氧化應激造成腦組織損傷，進而引起神經生化變化和行為障礙，最終導致腦衰老[20]。Benito等[21]研究表明，增加BDNF和STAT3的磷酸化水平，可以促進神經再生，改善神經損傷，并通過增加BDNF的表達和磷酸化STAT3也可以改善大鼠的記憶缺陷。本課題組前期研究表明，CH-I可顯著提高D-gal衰老小鼠海馬組織中的BDNF表達水平[8]。本實驗長期給予小鼠注射D-gal，增加小鼠海馬組織中的氧化應激損傷，表現為海馬組織中的SOD活性和GSH-Px活性顯著降低，抗氧化功能減弱，而MDA含量增加，說明氧化損傷加重，與既往的實驗結果一致[22-23]。本實驗給予CH-Ⅰ干預后，衰老模型小鼠的海馬組織中SOD、GSH-Px活性均顯著增加，MDA含量顯著降低，提示CH-Ⅰ可以提高海馬神經元的抗氧化能力，從而減輕神經元衰老損傷，起到神經保護作用。

綜上所述，CH-Ⅰ可有效降低衰老小鼠的老化度評分，改善衰老小鼠的自主行為障礙，減輕衰老小鼠的海馬神經元損傷，這可能是通過提高海馬神經元抗氧化能力，減輕氧化應激損傷實現的。

[參考文獻]

[1]? ?Foster TC，Defazio RA，Bizon JL. Characterizing cognitive aging of spatial and contextual memory in animal models[J]. Front Aging Neurosci，2012，4（12）：12-30.

[2]? ?Pluvinage JV，Wyss-Coray T. Systemic factors as medi- ators of brain homeostasis，ageing and neurodegeneration[J].Nat Rev Neurosci，2020，21（2）：93-102.

[3]? ?Pourhanifeh MH，Shafabakhsh R，Reiter RJ，et al. The effect of resveratrol on neurodegenerative disorders：Possible protective actions against autophagy，apoptosis，inflammation and oxidative stress[J].Curr Pharm Design，2019，25（19）：2178-2191.

[4]? ?Bettio LEB，Rajendran L，Gil-Mohapel J. The effects of aging in the hippocampus and cognitive decline[J]. Neurosci Biobehav Rev，2017，79：66-86.

[5]? ?Cao W，Zhang C，Chen R，et al. A novel cerebroprotein hydrolysate，CH1，ameliorates chronic focal cerebral ischemia injury by promoting white matter integrity via the Shh/Ptch-1/Gli-1 signaling pathway[J].Neuropsych Dis Treat，2020，16：3209-3224.

[6]? ?Zhang Y，Chopp M，Gang Zhang Z，et al. Prospective，randomized，blinded，and placebo-controlled study of cerebrolysin dose-response effects on long-term functional outcomes in a rat model of mild traumatic brain injury[J]. J Neurosurg，2018，129（5）：1295-1304.

[7]? ?Yang Y，Zhang Y，Wang Z，et al. Attenuation of acute phase injury in rat intracranial hemorrhage by cerebrolysin that inhibits brain edema and inflammatory response[J]. Neurochem Res，2016，41（4）：748-757.

[8]? ?Zhu L，Liu Y，Wu X，et al. Cerebroprotein hydrolysate-Ⅰ protects senescence-induced by D-galactose in PC12 cells[J]. Food Sci Nutr，2021，9（5）：3722-3731.

[9]? ?Hosokawa M，Kasai R，Higuchi K，et al. Grading score system：A method for evaluation of the degree of senescence in senescence accelerated mouse（SAM）[J]. Mech Ageing Dev，1984，26（1）：91-102.

[10]? Wang ZL，Chen LB，Qiu Z，et al. Ginsenoside Rg1 ame-liorates testicular senescence changes in D galinduced aging mice via anti inflammatory and antioxidative mechan- isms[J]. Mol Med Rep，2018，17（5）：6269-6276.

[11]? Smith KL，Kassem MS，Clarke DJ，et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD[J].Brain Behav Immun，2019，80：889-899.

[12]? McCubrey JA，Lertpiriyapong K，Steelman LS，et al. Effects of resveratrol，curcumin，berberine and other nutraceuticals on aging，cancer development，cancer stem cells and microRNAs[J].Aging（Albany NY），2017，9（6）：1477-1536.

[13]? Zhao H，Liu Y，Zeng J，et al. Troxerutin cerebroprotein hydrolysate injection ameliorates neurovascular injury induced by traumatic brain injury-via endothelial nitric oxide synthase pathway regulation[J].Int J Neurosci，2018， 128（12）：1118-1127.

[14]? Ma W，Wang S，Liu X，et al. Protective effect of troxerutin and cerebroprotein hydrolysate injection on cerebral ischemia through inhibition of oxidative stress and promotion of angiogenesis in rats[J].Mol Med Rep，2019， 19（4）：3148-3158.

[15]? Rockenstein E，Desplats P，Ubhi K，et al. Neuropeptide treatment with cerebrolysin improves the survival of neural stem cell grafts in an APP transgenic model of Alzheimer′s disease[J].Stem Cell Res，2015，15（1）：54-67.

[16]? Lu X，Zhou Y，Wu T，et al. Ameliorative effect of black rice anthocyanin on senescent mice induced by D-galactose[J]. Food Funct，2014，5（11）：2892-2897.

[17]? Yu C，Bai YX，Xu XP，et al. Behavioral abnormality along with NMDAR-related CREB suppression in rat hippocampus after shortwave exposure[J].Biomed Environ Sci，2019，32（3）：189-198.

[18]? Martínez E，Navarro A，Ordóez C，et al. Oxidative stress induces apolipoprotein D overexpression in hippocampus during aging and Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis，2013，36（1）：129-144.

[19]? Vanni S，Colini Baldeschi A，Zattoni M，et al. Brain aging：A Ianus-faced player between health and neurod egener- ation[J]. J Neurosci Res，2020，98（2）：299-311.

[20]? Sha JY，Zhou YD，Yang JY，et al. Maltol（3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone）slows D-galactose-induced brain aging process by damping the Nrf2/HO-1-mediated oxidative stress in mice[J].J Agric Food Chem，2019，67（37）：10 342-10 351.

[21]? Benito C，Davis CM，Gomez-Sanchez JA，et al. STAT3 controls the long-term survival and phenotype of repair Schwann cells during nerve regeneration[J].J Neurosci，2017，37（16）：4255-4269.

[22]? Khan M，Ullah R，Rehman SU，et al.17β-Estradiol modu- lates SIRT1 and halts oxidative stress-mediated cognitive impairment in a male aging mouse model[J]. Cells，2019， 8（8）：928-948.

[23]? Garcez ML，Cassoma RCS，Mina F，et al. Folic acid prev- ents habituation memory impairment and oxidative stress in an aging model induced by D-galactose[J].Metab Brain Dis，2021，36（2）：213-224.

（收稿日期：2021-08-03）