外泌體的生物學功能及牛乳源性外泌體資源開發進展

杜春梅 權素玉 南雪梅 熊本海*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193；2.天津農學院，動物科學與動物醫學學院，天津300384)

所有的細胞，原核生物和真核生物在正?；虍惓５纳頎顟B均能釋放細胞外囊泡[1]。根據大小及釋放方式，可將細胞外囊泡分為外泌體、細胞微泡和凋亡小體[2]。表1總結了這3種細胞外囊泡的主要特征。研究發現細胞外囊泡在細胞間通訊[3]、免疫應答[3-5]和傳遞外源性化合物到受體細胞均發揮重要的作用[6]。其中，外泌體是多囊泡體(multivesicular body，MVB)和質膜融合，通過胞吐作用向細胞間隙中分泌的直徑最小(30～150 nm)的胞外囊泡[7]，且外泌體幾乎存在所有的體液中，包括人類和動物的乳汁[8-11]。

表1 3種細胞外囊泡的特征

在哺乳動物的飲食來源中，牛乳是消耗最多的飲品之一，且含有豐富的外泌體。外泌體可通過與質膜融合或內吞作用被細胞攝取[12]。根據不同的受體介導，內吞方式可分為：網格蛋白介導的內吞作用、小窩蛋白介導的內吞作用、脂筏介導的內吞作用、巨胞飲作用和吞噬作用。此外，外泌體的攝取還取決于細胞類型、生理狀態以及外泌體表面的配體是否可識別細胞表面的受體[13]。研究表明，牛乳外泌體在哺乳動物出生后參與合成代謝，促進生長和完善免疫系統；同樣有報道指出，牛乳外泌體所攜帶的部分內容物可引起一些慢性疾病的發展，如肥胖、2型糖尿病、骨質疏松癥、常見癌癥(前列腺癌、乳腺癌、肝癌)和帕金森病[14]。因此，本文綜述了外泌體的組成及分選機制，并比較了外泌體的分離方法、在體內的分布和生物學功能，以期為國內牛乳外泌體的研究與開發提供參考。

1 外泌體的主要成分及分選機制

1.1 蛋白質

外泌體中的蛋白質僅來源于細胞溶質、內吞小泡或細胞膜，沒有內質網、高爾基體和細胞核相關的蛋白質[20]。有研究發現，泛素化在蛋白質翻譯后修飾中發揮重要作用，其主要調控Fas配體進入MVB[21]，這一過程由轉運必需核內體復合物(endosomal complex required for transport，ESCRT)介導，對維持外泌體中蛋白質的水平和功能具有重要意義。外泌體中的蛋白質與外泌體的形成和功能密切相關，例如，ESCRT中含有凋亡轉接基因2互作蛋白X(Alix)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)；小GTP結合蛋白家族(Rab27a、Rab11b和ARF6)參與外泌體的形成和釋放；此外，外泌體中含有四跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9)、參與信號轉導的蛋白[表皮生長因子受體(EGFR)]、抗原呈遞[組織相容性復合體(MHC)Ⅰ和MHCⅡ)]和其他跨膜蛋白[溶酶體關聯膜蛋白1(LAMP1)和轉鐵蛋白(TFR)][13]。乳外泌體中的蛋白質不僅可作為營養物質，還在調節免疫系統方面發揮重要作用[22]。Samuel等[23]從初牛乳和成熟牛乳的外泌體中分別鑒定出8 124和4 443個蛋白質，發現初牛乳外泌體中的蛋白質與免疫反應和細胞生長息息相關。

1.2 脂質

脂質對外泌體發揮生理功能有重要作用，但其相關研究較少。目前為止，ExoCarta數據庫顯示，1 116種脂類在外泌體中被發現。雖然不同細胞分泌的外泌體在脂質組成上存在差異，但其雙分子層主要包含磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PIs)、磷脂酸(PA)、膽固醇、神經酰胺、鞘磷脂、鞘糖脂和其他低濃度的脂類[24-25]。外泌體中的神經酰胺、膽固醇和鞘脂等構成的脂質筏在傳遞免疫信號過程中發揮較大作用[24]。除牛乳以外，其他來源的外泌體中的膽固醇和鞘磷脂組成不依賴于供體細胞，而飽和脂肪酸中的PC和PE的含量則與供體細胞有關[26]。薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)和質譜(MS)是最常用的脂質分析技術，對脂質進行全面研究有助于闡明外泌體的生物學功能。

1.3 核酸

在外泌體中發現了多種遺傳物質。在少數情況下，外泌體含有DNA，包括單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、線粒體DNA，甚至是反轉錄互補DNA[27-28]。但總體而言，外泌體中含有豐富的非編碼RNA，主要包括miRNAs、tRNAs、rRNAs、snRNAs、piRNAs、snoRNAs和RNA碎片[29-30]。外泌體中的RNA與細胞中的RNA具有相似的形態，但外泌體中的RNA種類更加固定[30]。其中，miRNAs在轉錄后水平上調控基因表達和蛋白質合成，參與細胞增殖、分化、凋亡和免疫系統發育，是外泌體中含量豐富且重要的一種RNA[31-32]。Quan等[33]在牛乳外泌體中共鑒定出273種miRNAs，且大部分與免疫相關。然而，外泌體如何分選miRNAs尚無定論，目前存在4種假說：第一，神經鞘磷脂酶2(neural sphingomyelinase 2,nSMase2)依賴途徑。nSMase2是第1個被報道與外泌體分選miRNAs有關的蛋白質。Kosaka等[34]發現過表達nSMase2可增加外泌體miRNAs的數量，而抑制nSMase2表達則減少了外泌體miRNAs的數量。第二，miRNA基序和核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)依賴途徑。Villarroya-Beltri等[35]發現，單糖基化的hnRNPA2B1可以識別miRNAs序列中3’端的特定的基序(GGAG)，并使其進入外泌體。此外，hnRNPA1和hnRNPC也是hnRNPs家族蛋白，似乎也參與外泌體分選miRNAs，但具體機制尚不清楚[35]。第三，依賴于miRNA的3’端序列。Koppers-Lalic等[36]發現尿苷化的3’端有利于直接將miRNAs分揀到外泌體中，而3’端腺苷酸化miRNAs主要存在細胞中。第四，miRNAs誘導沉默復合體(miRNA induced silencing complex,miRISC)相關途徑。成熟的miRNAs可結合真核翻譯起始因子2C2(AGO2)形成miRISC，從而調控miRNAs是否加載到外泌體中。Guduric-Fuchs等[37]發現，敲除AGO2可降低某些miRNAs的種類和豐度?？傊?，miRNAs中的特定序列，某些酶和蛋白質都可能控制外泌體分選miRNAs。

2 外泌體的分離方法

外泌體的分離方法可在一定程度上決定外泌體的質量。根據外泌體的特定特性，如密度、形狀、大小和表面蛋白質，其分離方法可分為：差速超速離心、密度梯度離心、超濾、排阻色譜、聚合物沉淀、微流體分離和等電沉淀。表2呈現了每種分離技術的優缺點。

表2 外泌體分離技術及其優缺點

3 外泌體在體內的分布

了解外泌體在體內的具體分布可更有針對性地去研究其生物學功能。Munagala等[45]用細胞膜近紅外熒光探針(DiR)標記的牛乳外泌體灌胃裸鼠發現，外泌體主要分布在肝臟、脾臟、胰腺和腎臟中，少量存在結腸、肺和大腦中。Manca等[46]用不同濃度的外泌體灌胃小鼠發現，牛乳外泌體主要聚集在腸黏膜、肝臟和大腸中，而在其他組織中的濃度很低；與雌性小鼠相比，雄性小鼠器官中的外泌體濃度更低，表明性別會影響外泌體在體內的分布。當外泌體表面的蛋白質被胰蛋白酶處理后，外泌體在肝臟中的含量較少；而用氯膦酸鈉清除小鼠體內的巨噬細胞后，灌胃的外泌體幾乎只聚集在肝臟中；這表明牛乳中外泌體在機體內的分布與外泌體表面的蛋白質和機體中的巨噬細胞密切相關[46-47]。

外泌體中的RNA與外泌體的分布不同，其主要分布在脾臟和大腦中[46]。據推測，miRNAs可將外源乳外泌體轉移到內源性外泌體并轉運到大腦，但這一理論尚未被證實。miRNA-34a與空間認知功能、海馬神經發生和大腦衰老有關，將合成的miRNA-34a轉移到牛乳外泌體后發現其主要在大腦中積累[48-49]。此外，miRNAs的分布不僅取決于組織中互補mRNAs的豐富度[31]，還取決于miRNAs的序列，它可以結合核糖核酸蛋白，促進miRNAs分選到外泌體中[50]。

4 外泌體在體內的利用

4.1 腸道細胞

外泌體因其獨特而穩定的脂質雙層膜，可攜帶其內容物躲避胃腸道的消化，直接被部分細胞吸收或進入大腸。Izumi等[51]發現，乳中外泌體可被人巨噬細胞吸收，進而將功能性RNA傳遞到人類機體中，但是其對巨噬細胞的影響還尚未可知。體外試驗發現乳中外泌體可被人腸細胞、原代大鼠小腸細胞和人臍帶血管內皮細胞吸收，并促進增殖[52-53]。此外，乳中外泌體還可促進大腸桿菌和植物乳桿菌WCFS1等細菌的生長并改變基因的表達，可能有助于維持腸道穩態和改善胃腸道功能[54]。

4.2 腸道微生物

約75%的牛乳外泌體可逃避細胞的吸收直接進入大腸，是腸道微生物和機體發生互作的介質[46]。一方面，外泌體可直接影響腸道菌群結構進而影響機體的健康。研究發現，在門水平上，牛乳外泌體對小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度無現在影響，在科水平上，增加了梭菌科、瘤胃球菌科和毛螺旋菌科的相對豐度，對其他菌群無顯著影響[55-56]。其中，瘤胃球菌科和毛螺旋菌科可維持腸道健康和改善小鼠營養不良[57]；此外，瘤胃球菌科與動脈粥樣硬化密切相關[58]，而毛螺旋菌科可預防艱難梭菌感染和肥胖[59-60]。另一方面，外泌體可調控腸道菌群的代謝產物進而發揮作用。腸道內容物中的短鏈脂肪酸(SCFAs)是目前研究較多的代謝產物，可維持腸道黏膜的完整性，改善糖脂代謝，控制能量消耗，調節免疫系統和炎癥反應[61]。Tong等[55]發現口服牛乳中的外泌體可提高小鼠糞便中乙酸、丙酸和丁酸的濃度，但對總揮發性脂肪酸和其他短鏈脂肪酸的濃度沒有顯著影響；然而，外泌體是否會影響菌群的其他代謝產物仍有待評估。

5 乳中外泌體的生物學作用及資源開發

5.1 有益功能及資源開發

外泌體中含有豐富的miRNAs，可在轉錄和轉錄后水平上調控基因的表達，從而調節動物的生理過程[62]。此外，某些外泌體中的miRNAs與免疫應答相關，尤其是let-7家族[63]。Tong等[55]報道，牛乳外泌體可增加小鼠腸道中的吸收細胞，增加腸絨毛高度和隱窩深度，促進腸道中黏糖蛋白2、胰島再生源蛋白(RegⅢγ)、髓樣分化因子和轉錄因子的基因表達，提高腸中免疫球蛋白A(IgA)和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平，進而增強腸道免疫。此外，有研究發現，牛乳外泌體中的miRNA-148a和miRNA-21可靶向Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶1和抑制DNA甲基轉移酶的活性，從而改善腸道屏障功能和緩解潰瘍性結腸炎，這表明乳中外泌體可在炎癥性腸病患者的腸內營養配方中作為一種營養素[64-65]。Yun等[66]發現牛乳中外泌體可提高骨質疏松模型小鼠的骨密度和恢復腸道菌群結構，進而用于預防骨質疏松，改善骨骼的健康。Arntz等[67]報道乳中外泌體可通過直接或間接調節腸道中的T細胞的分化治療自身免疫性關節炎。Wang等[68]發現，牛乳外泌體可減輕腸隱窩上皮細胞在氧化應激下的嘌呤核苷酸代謝，改善細胞能量狀態，對氧化應激具有保護作用。Gao等[69]發現，牛乳外泌體中的miRNAs可顯著提高大鼠腸上皮細胞(IEC-6)中脯氨酸羥化酶的表達，降低低氧誘導因子-α及其下游的血管內皮生長因子的表達，進而減輕缺氧對腸道的損傷。此外，牛乳外泌體中的ncRNAs可能在免疫調節、表觀遺傳調節、代謝疾病和靶向治療中發揮生物學作用，然而，關于牛奶外泌體中ncRNAs的來源、攝取和生理作用等的研究較少，還要很多問題亟待解決[70]。

牛乳源性外泌體的脂質雙分子層不僅可提高藥物的溶解性，還可保護其化學成分不被降解。Munagala等[45]首次證明了牛乳源性外泌體可攜帶藥物并實現腫瘤靶向性治療。Agrawal等[71]發現口服牛乳源性外泌體給藥與腹腔注射給藥具有相似的治療效果。因此，牛乳源性外泌體作為親水和親脂藥物(包括化療藥物)的載體具有巨大的潛力。

5.2 潛在風險

然而，目前對牛乳源性外泌體的生物學功能研究并不全面，仍存在很多爭議。流行病學家指出，牛乳源性外泌體可能會引入病原體從而引發一系列的疾病，還可能激活與衰老相關的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)的活性，降低人的壽命，增加死亡率[14,72]。首先，牛乳源性外泌體可增加巨大胎兒的發生率，有研究發現，懷孕期間牛奶攝入量與胎盤和出生體重變化呈正相關[73]。miRNA-21是牛乳中外泌體的標志miRNAs[74-75]，可到達胎盤并促進胎盤滋養層細胞的生長。此外，周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN1C、p57kip2)的缺失突變可導致5%～10%的嬰兒出現過度生長綜合征、巨舌、腹壁缺損等現象[76-77]；而miRNA-21是直接靶向CDKN1C的因子之一[78]，進一步提高巨大胎兒的發生率。其次，牛乳源性外泌體可誘發肥胖。外泌體中的miRNAs在間充質干細胞形成的脂肪細胞中發揮重要的促進作用[79-80]。Wnt1和Wnt10b可抑制脂肪細胞形成，而外泌體中的miRNA-148a可抑制其表達，此外，miRNA-148a還可抑制DNA甲基化轉移酶家族(DNMT)的活性而促進脂肪細胞分化[81-83]。外泌體中的miRNA-21和miRNA-29b均可促進脂肪細胞增殖分化[84-85]；miRNA-155可通過減弱棕色脂肪組織的分化和產熱，促進白色脂肪組織的儲存，進一步促進肥胖[86]。此外，長期暴露于miRNA-148a和miRNA-21可能會誘發動脈粥樣硬化，從而可能增加心血管發病率和死亡率[14]。外泌體中miRNA-155是侵入大腦的主要免疫調節miRNAs之一[46]，在α-突觸核蛋白(α-syn)相關的神經退行性疾病中發揮著核心作用[87]，可能是帕金森病發生的關鍵因子。最后，外泌體中的一些miRNAs在前列腺癌、乳腺癌和肝細胞癌等一系列疾病中也發揮作用[14]。

6 小 結

外泌體作為一種功能性的微型囊泡，不僅可介導細胞間通訊，還在機體生理病理過程中發揮重要作用。已有研究表明，牛乳源性外泌體可調節腸道的菌群結構，有利于免疫調控，以及緩解腸炎和骨質疏松等疾病，表明牛乳源性外泌體可被機體有效利用，有望成為一種新型的功能性食品。此外，牛乳源性外泌體特殊的生物學結構可使其成為實用的藥物載體，傳輸藥物作為疾病的靶向治療。但是，牛乳源性外泌體可能會傳遞某些有害的物質，從而誘發疾病。因此，有必要全方位了解牛乳外泌體的生物學功能，從而為開發相關產品提供理論依據。