黃河鯉肌肉發育關鍵因子的多克隆抗體制備及驗證

運瑩豪 宋東鎣 和子杰 米佳麗 王璐明 聶國興*

(1.河南師范大學水產學院，新鄉453007；2.寧波大學海洋學院，寧波315211)

動物的生長主要是骨骼肌的生長，肌纖維的形成受到多種轉錄因子的調控，其中生肌調節因子(myogenic regulatory factors，MRFs)家族、肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)等為正向調節因子，肌細胞生長抑制素(myostatin，MSTN)等為反向調節因子[1]。在脊椎動物的研究中已經發現MRFs家族的4個成員，分別是肌肉轉錄調節因子(myogenic differentiation antigen，MyoD)、生肌因子5(myogenic factor 5，Myf5)、肌細胞生成素(myogenin，MyoG)和生肌調節因子4(myogenic regulatory factor 4，MRF4)。它們具有不同的時空表達特性，其中MyoD和Myf5主要在成肌過程的早期表達，參與成肌細胞的決定和維持；MyoG和MRF4主要參與肌細胞的終末分化過程，是骨骼肌特異性蛋白基因表達的主要調節因子[1-2]。有研究表明，魚類骨骼肌在嵌合型生長階段，MyoD、Myf5和MEF2等基因持續表達。一旦此階段基因的表達受阻，魚類個體的生長則受到抑制，致使個體變小[1,3-5]。因此，及早地激活嵌合型生長階段，對魚苗和幼魚階段的肌肉發育和個體體重的增加極為重要。

有研究發現配對盒轉錄因子3(paired box 3，Pax3)和配對盒轉錄因子7(paired box 7，Pax7)的高表達是肌衛星細胞的特異性標志，同時，它們在肌衛星細胞增殖和分化中發揮重要作用，Pax7被作為體外培養肌衛星細胞的鑒定基因[6]。Pax3和Pax7作為轉錄因子直接調節生肌調節因子Myf5和MyoD的表達，繼而影響肌細胞分化。通過基因表達和細胞定位研究揭示，肌衛星細胞通過非對稱性細胞分裂來維持生肌細胞的激活和自我更新，即一部分來自肌衛星分裂的子細胞維持著干細胞功能，而另一些子細胞則被激活形成肌細胞進而發育成肌纖維[1,7]。

然而，水產養殖動物關于肌源性生長轉錄因子在蛋白質水平的檢測相對較少，大部分局限于轉錄水平的檢測，這種局限性制約了水產動物肌肉發育調控更深入的研究。因此，本研究以黃河鯉白肌為原材料，通過原核表達技術獲得重要的含有抗原決定簇的4種肌肉發育的關鍵因子(Pax7、MyoD、MyoG和MRF4)的融合蛋白，經過純化之后免疫新西蘭大耳兔(Oryctolaguscuniculus)，獲得相應的鯉多克隆抗體，并以此為工具，檢測黃河鯉白肌組織中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4在蛋白質水平的表達情況，為探究黃河鯉肌肉發育的調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新西蘭大耳兔購自河南省新鄉市新鄉醫學院，pMD 19-T Vector(Code No.6013)購自寶生物工程(大連)有限公司，pET21a(+) Vector、DH5α和BL211(DE3)受體菌為本實驗室保存。

1.2 鯉肌肉總RNA的提取及反轉錄

無菌條件下取300～500 mg黃河鯉肌肉組織，Trizol法提取樣品總RNA，總RNA質量及濃度用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，美國)測定，以206和280 nm處吸光度值的比值為1.80～2.10作為RNA質量和純度的標準，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行定性檢驗。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉錄，按照試劑盒說明書獲得第1鏈cDNA。

1.3 含抗原決定簇基因片段的工程菌的構建

1.3.1 目的基因引物設計

經NCBI數據庫查閱黃河鯉肌肉發育關鍵基因Pax7、MyoD、MyoG和MRF4的序列全長，將開放閱讀框(ORF)翻譯成為蛋白質序列，利用DNAstar軟件的Lasergene程序中protean子程序進行蛋白質序列的抗原決定簇預測分析。采用Primer 5.0分別設計上述基因的特異性引物，分析并添加特定的酶切位點。表達載體為pET21a(+)，感受態細胞為BL21(DE3)，基因的引物序列及相關信息如表1所示。

表1 原核表達相關基因的引物序列及相關信息

1.3.2 目的基因的PCR擴增

使用2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)擴增目的基因。反應體系包括2×Phanta Max Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，共20 μL。試劑混勻后迅速離心，PCR擴增程序為：95 ℃ 3 min，預變性；95 ℃ 30 s，變性，55 ℃ 15 s，復性，72 ℃ 30 s，延伸，共35個循環；72 ℃ 10 min和12 ℃暫存(暫存時間不超過30 min，PCR擴增程序結束后及時取出反應產物，進行下一步試驗)。

1.3.3 目的片段的膠回收

采用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(CW2302A，江蘇康為世紀生物科技有限公司)回收凝膠中的DNA目的片段。

1.3.4 重組克隆質粒的構建

將回收的目的片段連接到pMD19-T克隆載體上。反應體系包括2×Solution I 5 μL，目的基因4.5 μL，pMD19-T Vector 0.5 μL，共10 μL?；靹蚝笱杆匐x心，置于PCR儀中，16 ℃過夜進行T-A連接。

1.3.5 重組克隆質粒的轉化與篩選

采用熱激法將連接產物轉入感受態細胞DH5α內。選取陽性克隆，將其菌液逐級培養，用30%甘油溶液于-80 ℃保存。提取陽性克隆質粒，一部分質粒于-80 ℃保存，一部分質粒則送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序驗證。

1.3.6 重組質粒DNA的提取

采用質粒抽提試劑盒(D6943-02，OMEGA，美國)按照說明書提取質粒DNA。

1.3.7 重組表達質粒的構建、轉化及篩選

1.3.7.1 重組克隆質粒的雙酶切

將陽性重組克隆質粒pMD-19T-Pax7、pMD-19T-MyoD、pMD-19T-MyoG和pMD-19T-MRF4進行雙酶切。反應體系為重組質粒(recombinant plasmid) 5 μL，10×Buffer 5 μL，BamH Ⅰ 2 μL，Hind Ⅲ 2 μL，ddH2O 36 μL，共50 μL。37 ℃水浴孵育過夜，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切位點的黃河鯉Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段并回收。利用上述步驟進行表達載體pET21a(+)的雙酶切及產物純化回收。

1.3.7.2 目的片段與表達載體的連接

將含有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切位點的黃河鯉Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段與表達載體pET21a(+)的雙酶切產物進行連接。反應體系為2×T4 Buffer 5 μL，雙酶切基因片段3 μL，pET21a(+) 1 μL，T4 Ligase 1 μL，共10 μL?；靹蚝笱杆匐x心，置于PCR儀，16 ℃過夜進行T4連接。

1.3.7.3 T4連接產物的轉化、篩選及陽性重組表達質粒的提取

將T4連接產物轉入pGEM-T感受態中，隨后進行篩選和陽性重組表達質粒的提取。

1.3.8 重組表達質粒的雙酶切驗證

用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對陽性重組表達質粒pET-21a-Pax7、pET-21a-MyoD、pET-21a-MyoG和pET-21a-MRF4進行雙單酶切驗證，方法與重組克隆質粒雙酶切相同。酶切產物經電泳檢測，采集并分析電泳圖像。將一部分篩選得到的陽性克隆質粒于-20 ℃保存備用，一部分送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序驗證。

1.4 重組蛋白的原核表達

1.4.1 表達菌株的制備

將1.3中構建好的重組表達質粒pET-21a-Pax7、pET-21a-MyoD、pET-21a-MyoG和pET-21a-MRF4通過熱激轉化到表達感受態大腸桿菌BL21中，并篩選陽性克隆。將獲得的陽性克隆接種于LB培養液(含氨芐青霉素100 μg/mL)，37 ℃下200 r/min振蕩過夜培養。

1.4.2 目的重組蛋白的誘導表達

無菌條件下，取培養過夜的菌液5 mL加入到250 mL LB培養液中，37 ℃下200 r/min振蕩擴大培養，至菌液600 nm處吸光度值達到0.5～0.6時(2.5～3.0 h)，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度1 mmol/L)誘導劑，37 ℃下200 r/min振蕩誘導培養6 h，期間每小時分別取菌液1 mL，用于后續蛋白表達的驗證。

1.4.3 目的重組蛋白的檢測

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)的方法檢測原核表達的融合蛋白，以未經IPTG誘導的菌體作為對照。

1.4.4 重組蛋白的純化

經SDS-PAGE檢測到目的蛋白表達后，采用1 mL鎳離子預裝柱(HisTrapTMexcel)對表達的重組蛋白進行純化。室溫條件下8 000×g離心2 min，收集菌體，將收集到的菌體用平衡緩沖液[equilibration buffer，20 mmol/L磷酸(PB)緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，pH 7.4]重懸浮，重懸浮的菌體在冰浴中進行超聲波裂解(6 mm變幅桿，35%功率，3.5 s工作，7 s休息，裂解60～120 min，至溶液由渾濁變清透，由黏稠變不黏稠表明裂解完成)。裂解后獲得目的重組蛋白，借助清洗緩沖液(wash buffer，20 mmol/L PB緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，20 mmol/L咪唑，pH 7.4)和洗脫緩沖液(elution buffer，20 mmol/L PB緩沖液，500 mmol/L NaCl溶液，250 mmol/L咪唑，pH 7.4)對重組蛋白進行純化。將收集到的目的蛋白進行SDS-PAGE檢測分析，于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。用透析方法最大限度去除純化后重組蛋白溶液中的尿素和咪唑等離子。

1.5 多克隆抗體的制備

1.5.1 重組蛋白免疫動物

將分裝的1 mL重組蛋白(約300 μg/mL)+1 mL完全弗氏佐劑/不完全弗氏佐劑，用破碎儀充分混勻，檢查乳化程度(將乳化好的重組蛋白溶液滴在水面上，如果液滴不擴散，表明重組蛋白和佐劑已達到“油包水”的完全乳化狀態)。采用耳緣靜脈注射和多點皮下注射的方法免疫新西蘭大耳兔[8]，每周免疫1次，共計免疫5次，初次免疫用的乳化劑為完全弗氏佐劑，后續的乳化劑為不完全弗氏佐劑。

1.5.2 兔源多克隆抗體效價的檢測

采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的方法檢測新西蘭大耳兔血清中抗體的效價。重組蛋白最后1次免疫新西蘭大耳兔前1周進行耳緣靜脈采血，將純化的重組蛋白用包被液稀釋至10 μg/mL，向酶標板中加入抗原100 μL/孔，4 ℃過夜包被。使用封閉液[10 g脫脂奶粉溶于100 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液]37 ℃孵育2 h后用抗體稀釋液對兔源血清進行倍比稀釋(稀釋倍數：100、1 000、10 000、30 000、90 000、270 000、810 000、2 430 000)，向酶標板中依次加入100 μL/孔的稀釋血清，37 ℃孵育2 h，以未免疫的兔源血清為對照組。用抗體稀釋液按1∶20 000的比例稀釋羊抗兔二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)[HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG (H+L)]，向酶標板中依次加入100 μL/孔的稀釋二抗，37 ℃孵育1 h。加入100 μL/孔的顯色液，37 ℃孵育30 min，終止液為2 mol/L H2SO4溶液，每孔加入50 μL，在酶標儀中讀取450 nm處的吸光度值，統計結果。

抗體效價判定標準：試驗組與陰性對照組的吸光度值比值應≥2，血清的最大稀釋倍數為待測抗體的效價?？贵w效價檢測達標后，通過頸動脈插管取血，以獲得免疫血清，分裝后于-80 ℃保存備用。

1.6 黃河鯉肌肉組織免疫熒光驗證

隨機選取3尾黃河鯉(n=3)，從其背鰭前下方側線以上區域取5 mm×5 mm×5 mm大小的肌肉組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中固定，然后經過梯度酒精脫水后使用石蠟包埋，對包埋好的肌肉組織塊進行切片，每個多克隆抗體在3尾黃河鯉肌肉組織塊的6個平行切片樣品上進行驗證，經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后，使用H2O2(8 mL甲醇+1 mL PBS緩沖液+1 mL 30 % H2O2)封閉內源性過氧化氫酶，再使用山羊血清(北京索萊寶科技有限公司)封閉后，分別使用抗Pax7、MyoD、MyoG和MRF4血清4 ℃孵育過夜，第2天使用熒光二抗HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG (H+L)孵育，再使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，最后用抗熒光淬滅劑封片，透明指甲油封邊。使用熒光顯微鏡對切片進行拍照，使用Image J對圖片熒光面積進行分析。

1.7 數據統計分析

試驗數據采用SPSS 22.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行統計分析，并采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 黃河鯉肌肉發育關鍵基因抗原決定簇片段的克隆

以黃河鯉肌肉的cDNA為模板，以1.3.1中的引物進行PCR擴增Pax7、MyoD、MyoG和MRF4基因的全長序列。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，分別在360、370、390和440 bp附近獲得1條特異性的條帶(圖1)，實際大小為364、373、388和442 bp，大小與預期一致。

Pax7：配對盒轉錄因子7 paired box 7；MyoD：肌肉轉錄調節因子 myogenic differentiation antigen；MyoG：肌細胞生成素 myogenin；MRF4：生肌調節因子4 myogenic regulatory factor 4。下圖同 the same as below。

2.2 原核表達載體的構建及酶切驗證

將Pax7、MyoD、MyoG和MRF4片段瓊脂糖凝膠純化后的酶切片段與pET-21a(+)質粒瓊脂糖凝膠純化后的酶切產物進行T4鏈接，得到重組表達質粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)。

對篩選獲得的陽性重組表達質粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)雙酶切(BamH Ⅰ和Hind Ⅲ)處理(圖2)，檢測Pax7、MyoD、MyoG和MRF4目的片段是否連接到表達載體pET-21a(+)上。酶切反應結束后，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結果(圖2)。1號和2號泳道分別為重組質粒和雙酶切片段。根據酶切結果可知pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)均為陽性重組表達質粒。

M:D2000 bp DNA ladder；1:重組質粒；2:重組質粒雙酶切片段。

2.3 重組表達質粒的測序鑒定

初步的陽性重組表達質粒經測序檢測，與NCBI數據庫中已提交的基因進行序列比對，序列同源性均在99 %以上，說明表達質粒pET-21a(+)中所插入的基因片段均為目的片段。

2.4 重組蛋白的誘導表達、純化與鑒定

2.4.1 重組蛋白的誘導表達

重組表達質粒pET-21a(+)-Pax7 (354 bp)、pET-21a(+)-MyoD(363 bp)、pET-21a(+)-MyoG(378 bp)和pET-21a(+)-MRF4 (432 bp)在大腸桿菌BL21中經IPTG誘導表達，并選用無IPTG誘導的含有重組表達質粒的菌液做陰性對照。重組蛋白電泳結果顯示：IPTG誘導后，重組表達質粒的菌液所在泳道均具有特異性蛋白條帶，大小分別約16、17、17和19 ku(圖3)(實際大小分別為15.60、16.90、16.91和19.35 ku)，而陰性對照在此位置沒有特異性蛋白條帶。

M:蛋白質marker (11～245 ku)；0：重組質粒無IPTG誘導組；1：重組質粒經IPTG誘導組。

2.4.2 目的蛋白的純化

收集表達重組目的蛋白菌體，超聲破碎后經鎳離子柱純化、半透膜透析和超濾等技術得到純化后的重組目的蛋白。PBS或未誘導的含有重組表達質粒的菌體做陰性對照(0號泳道)和純化的目的蛋白溶液(1號泳道)經SDS-PAGE檢測，結果如圖4所示。

M:蛋白質marker (11～245 ku)；0：陰性對照組；1：重組蛋白純化組；

2.5 多克隆抗體效價

采用ELISA的方法檢測收集的血清中多克隆抗體的效價，結果如表2、表3、表4、表5所示。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ列為試驗組的3個平行數據，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ列為對照組(未免疫兔血清)的3個平行數據。從表中可以看出，當兔源血清稀釋至2.43×106時，4種多克隆抗體的試驗組與對照組的效價比值均大于2，故判定制備的4種多克隆抗體的效價均達到2.4×106。

表2 ELISA方法測定多克隆抗體Pax7效價

表3 ELISA方法測定多克隆抗體MyoD效價

表4 ELISA測定多克隆抗體MyoG效價

表5 ELISA方法測定多克隆抗體MRF4效價

2.6 黃河鯉白肌中肌肉發育關鍵因子的蛋白免疫熒光檢測

鯉肌肉中肌肉發育關鍵因子的蛋白免疫熒光檢測及對比如圖5、圖6所示。數據分析顯示，黃河鯉白肌中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4蛋白免疫熒光信號強度無顯著差異(n=3,P>0.05)。

FITC:經異硫氰酸熒光素染色后的肌纖維橫截面；DAPI:經4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色細胞核的肌纖維橫截面；Merge:將2個圖進行合并后的肌纖維橫截面。

圖6 黃河鯉白肌中肌肉發育關鍵因子的

3 討 論

本試驗采用常規的多克隆抗體的制備方法，利用生物信息學方法從NCBI數據庫和國家生物信息中心(China National Center for Bioinformation，CNCB)搜集鯉的相關蛋白分子信息，經過分析Pax7、MyoD、Myogenin和MRF4 4個蛋白因子的分子序列特征，采用Protean、Primer 5.0、DNAMAN等軟件分析各個蛋白的抗原決定簇序列，經過基因克隆和蛋白表達試驗，獲得相應的融合蛋白，經過鎳離子親和層析柱的純化，透析和超濾富集，獲得高濃度的融合蛋白。在融合蛋白誘導表達的過程中，由于使用大腸桿菌的原核表達系統，個別融合蛋白以包涵體的形式出現，需要用高濃度的尿素溶液溶解，在后續的純化過程中，增加了融合蛋白變性的風險，盡管有些融合蛋白發生變性而沉淀，在后續的免疫過程中并不影響多克隆抗體的制備。但是，相關蛋白的細胞孵育試驗的功能驗證無法進行，因此需要優化純化和透析的試驗步驟或使用真核表達系統進行蛋白的表達，減小融合蛋白以包涵體形式出現的幾率。

本研究中，黃河鯉白肌中Pax7、MyoD、MyoG和MRF4蛋白免疫熒光信號強度無顯著差異，黃河鯉白肌中肌衛星細胞的維持、激活和復制過程與成肌細胞轉化為肌細胞、單核成肌細胞融合為多核成肌細胞、成肌細胞分化融合為肌管過程同步進行，肌纖維正常形成，即白肌中肌纖維的增生與增粗同時存在。本試驗所選用的4個蛋白因子是肌肉發育的不同階段的關鍵標志性蛋白，具有不同的時空表達特性。在哺乳動物中，出生后的肌纖維數目幾乎是固定的，生長主要依靠肌纖維的增粗[9]，增生對其生長的作用極小，僅發現在肌肉損傷后的生長中有新的肌纖維產生[10]，導致其存在有限的生長和固定的體型，屬于限定增長。魚類骨骼肌的生長調控是多樣的，大多數魚類骨骼肌的生長是非限定增長，出膜后的肌纖維數量不是固定的，在生命周期中涉及肌纖維的增生與增粗[11]，2種肌纖維的生長模式共同作用促進骨骼肌的持續生長。Pax7作為肌衛星細胞的特異性標志[12-13]，用來鑒定肌衛星細胞是否成功分離純化。用cRNA探針進行原位雜交試驗，證實了Pax7在單核肌衛星細胞中表達[14]。在胚后的生長發育中，肌衛星細胞的維持、激活、復制過程都呈現出Pax7的高表達[15]。Pax7的表達缺失時，機體會阻滯細胞周期和早熟分化，從而導致肌肉分化的缺陷[16-17]。MyoD可促使非成肌細胞向肌細胞轉化，并進一步促進肌細胞融合、分化為成熟的肌纖維；當MyoD表達缺失時，肌細胞的增殖和分化將無法進行。MyoG可以終止肌細胞的增殖，同時促使單核成肌細胞向多核肌細胞融合；當MyoG表達缺失時，成肌細胞則停止分裂與增殖，致使肌肉發育受阻[18]。MRF4可誘導成肌細胞分化融合成為肌管，并促進肌纖維的形成，同時也可維持肌細胞的穩定[19]，與MyoG共同控制肌肉的分化過程；當MRF4表達缺失時，小鼠的骨骼肌雖然形成，但卻因為肋骨存在生長缺陷，在出生后即死亡[20]。

本試驗成功制備了兔源性黃河鯉4個肌肉發育不同階段的關鍵標志性蛋白(Pax7、MyoD、Myogenin和MRF4)的多克隆抗體，經ELISA檢測，4種抗體的效價均達到2.4×106以上，這與本實驗室制備的鯉的營養素轉運載體和細胞因子的多克隆抗體的效價相似[8,21-22]，該結果初步表明所得的抗體可以滿足后續的分析。以本研究制備的多克隆抗體為一抗，用組織免疫熒光的方法檢測并驗證其在黃河鯉白肌組織石蠟切片的應用效果及穩定性，結果表明4種抗體可以用于黃河鯉白肌組織的相應的蛋白定量表達檢測，且特異性、穩定性和親和性均較高。

4 結 論

綜上所述，本試驗制備的穩定性及特異性較高的黃河鯉肌肉發育關鍵因子的多克隆抗體可以滿足鯉肌肉發育過程中相關蛋白表達的檢測和驗證，可為水產動物骨骼肌發育的調控機制研究提供有力的工具。