基于外殼蛋白基因的湖南煙草黃瓜花葉病毒遺傳多樣性分析

龔玉娟 滕凱 肖志鵬 蔡海林 周向平 肖艷松 劉天波 唐前君

摘要 為探明湖南煙草上發生的黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）的遺傳多樣性及分子進化特征，對來自湖南煙區的303份疑似感染病毒的煙草樣品進行檢測，分析CMV系統發育、遺傳變異和群體結構等特征。結果表明：部分分離物的外殼蛋白（coat protein， CP）基因與NCBI上登錄的CMV分離物的一致性為86.34%～98.42%;系統發育分析發現湖南煙草CMV分離物屬ⅠB組，不同組間的分離物地理特征不明顯，無重組現象，進化的主要驅動力是負選擇;組間遺傳變異比較明顯，基因交流頻率較低，受到遺傳漂變影響，遺傳多樣性高，群體趨于擴張。研究結果為煙草抗CMV育種提供了理論依據，對病害防治具有重要意義。

關鍵詞 煙草; 黃瓜花葉病毒; CP基因; 遺傳多樣性; 分子進化

中圖分類號： S435.72

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021061

Abstract In order to investigate the genetic diversity and molecular evolution of Cucumber mosaic virus （CMV） on tobacco in Hunan province， 303 suspected diseased samples from tobacco-growing areas in Hunan were detected， and the phylogeny， genetic variation and population structure of CMV were analyzed. The coat protein （CP） genes of some samples were cloned and compared with CMV isolates registered on NCBI. The results showed that the sequence of CP from Hunan isolates shared identity of 86.34%-98.42% with isolate from NCBI. Phylogenetic analysis showed that CMV isolates from Hunan tobacco plants belonged toⅠB group. The geographical characteristics of these isolates were not distinct among different populations， and there was no recombination phenomenon. The main driving force for evolution was negative selection. The genetic variation among groups was obvious; the frequency of gene flow was low; the genetic diversity was high， and the population tended to expand. These results provide a theoretical basis for breeding tobacco for disease resistance to CMV and are of great significance for disease control.

Key words tobacco; Cucumber mosaic virus; CP gene; genetic diversity; molecular evolution

黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus （CMV）是嚴重危害植物的病毒之一，其侵染煙草引發的病毒病在煙草上普遍發生，嚴重威脅我國煙葉生產[12]。培育抗病毒品種被認為是最有效的方法之一[3]，但因CMV受寄主和地域影響而變異較頻繁，抗病品種抗性易減弱或喪失，使抗病育種難度加大。通過生物信息學技術和方法分析CMV不同分離物的遺傳變異和分子進化，對抗CMV的品種選育和病害精準防控有重要意義。

CMV株系眾多，寄主范圍廣泛，存在較顯著的遺傳多樣性[4]。CMV基因組有3條正義單鏈的RNA分子，編碼復制酶1a、2a、2b、移動蛋白（movement protein， MP）、外殼蛋白（coat protein， CP）[5]共5個蛋白。CMV CP基因序列保守性較高，常被應用于病毒遺傳多樣性研究[6]。

根據癥狀、寄主范圍、致病性、抗原性、蚜傳特性以及核苷酸序列同源性的差異，CMV株系被分為亞組 Ⅰ和亞組 Ⅱ，在亞組 Ⅰ內根據CMV RNA3的5′端和非編碼區序列的比對結果，亞組Ⅰ進一步分為ⅠA和ⅠB[7]。

宋麗云[8]、劉勇等[9]鑒定分析了我國云南、湖南和福建等地CMV分離物，發現云南和湖南煙草CMV以亞組Ⅰ為主，存在較明顯的遺傳多樣性。

趙雪君等[10]報道四川CMV分離物屬亞組ⅠB。

隨著產區調整、種植品種和耕作制度等變化，湖南煙草CMV群體變化和分子變異情況尚不清楚。因此，利用CMV CP基因序列開展群體遺傳多樣性和分子進化分析，探明CMV的遺傳變異機制很有必要。本研究對湖南煙草中的CMV分離物CP基因進行RT-PCR擴增和測序，分析CMV分離物的遺傳多樣性和分子進化特征，以期為CMV株系鑒定和進化機制研究提供參考，為CMV的抗病育種和防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集：2017年-2018年從湖南郴州、永州、長沙等5個煙區采集表型為花葉、皺縮、畸形及脈壞死等癥狀的煙草葉片樣品303份，樣品經液氮速凍后于-80℃冰箱中保存備用。

主要試劑：RNA提取試劑盒（EasyPure Plant RNA Kit），購自TransGen Biotech公司;cDNA合成試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs購自北京全式金生物有限公司;其他常規試劑為國產分析純，購自中國醫藥集團有限公司。

1.2 煙草總RNA的提取及檢測

取煙草葉片樣品1 g，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，具體方法參照試劑盒說明書。以提取的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA。用于RT-PCR擴增的引物[11]序列為CMVF： 5′-CGGATGCTAACTTTAGAGTCTTGT-3′和CMVR： 5′-GAATGCGTTGGTGCTCGAT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，目標片段長度約650 bp。PCR反應參照Liu等[12]的方法，反應體系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.3 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，1 μmol/L模板DNA 0.5 μL，滅菌ddH2O補足至25 μL。擴增條件：95℃變性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸110 s，30個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，計算檢出率。

1.3 重組分析

將獲得的湖南煙草CMV分離物CP基因序列進行整理，先利用RDP 4.0[13]軟件包中的MAXCHI、RDP、CHIMAERA等軟件檢測可能存在的重組位點，然后利用Simplot軟件驗證這些重組位點存在的可能性[14]。如檢測結果P<1.0×10-6，則表明CMV分離物存在重組的可能;如P>1.0×10-6，則表明CMV分離物不存在重組[15]。

1.4 系統發育分析

將測序獲得的陽性樣品序列采用DNAMAN進行同源性比對。參照比對結果選取采自湖南不同地區、差異相對較大的11個樣品，同時從NCBI上下載32個來源不同國家或地區的CMV分離物 CP基因序列進行系統發育分析，采用MEGA 5.0中的Clustal W軟件進行序列比對，樣品編號或登錄號和來源地區或報道國家見表1。采用最大似然法構建系統進化樹（自展值1 000），以與CMV同屬的花生矮化病毒病Peanut stunt virus （PSV） 作為外群。依據Kimura two-parameter和DayhoffPAM 250 matrix計算分析核苷酸和氨基酸相似性[16]。

1.5 遺傳差異和基因交流

利用DnaSP 5.0軟件計算群體間遺傳差異與基因交流頻率。統計KS、Z和Snn 3個參數，Snn指近鄰統計（nearest-neighbor statistic），計算兩個或兩個以上的地區樣品近鄰序列在相同地域的地理學空間上出現的頻率;

Ks和Z是指以序列為基礎的數據統計分析[17]，

Ks由不同序列的數量所決定，Z是秩統計量（rank statistic）。如果Z和 KS統計值很小，P<0.05（兩個亞群之間沒有遺傳分化），則拒絕無遺傳差異的假說[18]。利用DnaSP 5.0 軟件計算Fst和Nm，依據Fst和Nm大小評估基因交流情況，Fst是指群體間遺傳差異的構成，表示群體間等位基因頻率的標準差異;Nm是指有效大小的單個群體數量以及它們之間的遷移率。如果Fst的絕對值大于0.33，說明基因交流不頻繁，反之，則交流頻繁[19];如果Nm大于1則說明基因漂變在群體間很容易發生;如果Nm小于1，則說明群體發生遺傳差異的主要原因是基因交流[20]。

1.6 選擇壓力分析

選擇壓力評價采用MEGA 5.0 中Pamilo-Bianchi-Li法，分別計算非同義突變（dN）和同義突變（dS）的值，利用dN/dS值預測各個基因所承受的選擇壓力[21]。若dN/dS=1則說明該組分離物處于中性選擇;若dN/dS<1則說明該組分離物處于負選擇壓力作用下;若dN/dS>1則說明該組分離物處于正向選擇作用下。

1.7 突變位點和保守區域分析

利用DnaSP 5.0 軟件分析CMV CP基因突變位點和保守區域。

1.8 群體結構分析

群體結構利用核苷酸多樣性與單體型多樣性評價，采用DnaSP 5.0計算核苷酸多樣性與單體型多樣性的差異值[22]。核苷酸多樣性差異值以0.005為臨界值，單體型多樣性差異值以0.5為臨界值，二者的值越大，表示群體的多樣性程度越高。

1.9 中性檢驗分析

中性檢驗分析基于Fu & Li’s D、Fu & Li’s F和Tajima’s D值評價，若上述3個參數均小于零，說明該群體多樣性較低，群體存在選擇壓力或呈擴張趨勢;若

這3個參數值大于零，說明群體數量趨于減少，群體處于收縮態勢[23]。

2 結果與分析

2.1 湖南煙區CMV檢測

對303份有花葉、皺縮、葉緣上卷等癥狀的煙草樣品進行PCR擴增，有192份樣品得到大小約為650 bp的片段（圖1），條帶大小符合預期，陽性檢出率63.37%（表2）。對PCR產物（CP基因）進行測序，并與NCBI上登錄的CMV分離物CP基因序列進行比對，結果顯示湖南煙區CMV分離物與NCBI上登錄的CMV分離物（登錄號KU976486、EF424776、HQ844075等）的一致性為86.34%～98.42%。

2.2 重組分析

對得到的CMV分離物CP基因序列進行重組分析，結果表明，P>1.0×10-6，CMV分離物CP基因無重組現象或重組現象不明顯。利用Simplot進一步確認，結果顯示不存在明顯重組事件。

2.3 系統發育分析

同源性比對顯示，192份陽性樣品序列一致性為93.35%。選取 11個湖南不同地區CMV分離物與32個已報道的不同國家或地區的CMV分離物 CP基因序列構建系統發育樹（圖2），結果發現CMV不同分離物形成ⅠA、ⅠB和Ⅱ3個組，ⅠA 組以亞洲（中國、日本、韓國）分離物為主，少部分為美國、匈牙利和西班牙分離物，ⅠB組以中國（湖南）分離物為主，其他為意大利、西班牙、印度尼西亞和菲律賓分離物，Ⅱ組主要為日本、南非、澳大利亞和美國分離物，不同組間的分離物地理特征不明顯。湖南CMV分離物屬于亞組ⅠB，不同地區的分離物在系統發育樹中聚集分布，來自長沙寧鄉（CS-NX）、湘西龍山（XX-LS）、郴州永興（CZ-YX）的3個分離物稍微分散，其他地區分離物地理特征不明顯，遺傳距離較近，一致性較高，核苷酸序列的一致性為93.8%～96.6%，氨基酸的一致性為95.9%～96.9%。

2.4 遺傳差異和基因交流

系統發育分析將43個CMV分離物分成ⅠA、ⅠB和Ⅱ 3個組，對這3個組進行遺傳差異分析，結果顯示不同組間的KS和Z值較小，P值也較小，接近于0，遠小于0.001，表明CMV在不同組間的遺傳差異比較明顯（表3）?；蚪涣鞣治鼋Y果顯示，CMV不同組間的Fst值均大于0.33，表明CMV在不同組間基因交流頻率不高。CMV不同組間Nm均小于1，表明群體可能受到遺傳漂變影響。

2.5 選擇壓力分析

利用dN和dS預測不同群組分離物非同義突變率和同義突變率，分別計算dN和dS值，估量CP基因序列的選擇壓程度（表4）。結果顯示dN值小于dS值，dN/dS均小于1，表明CMV不同群體受負選擇壓力較強，負選擇可能是CMV進化的主要驅動力。

2.6 突變位點和保守區域分析

突變位點分析發現，CMV CP基因有可變位點260個，單突變位點128個，其中2個變異型位點119個，3個變異型位點9個。保守區域分析發現（表5），CMV CP基因保守區域共有3個，保守性為0.54，表明 CMV CP基因突變率很低，比較保守。

2.7 群體結構分析

群體結構分析結果表明（表6），ⅠA、ⅠB和Ⅱ 3個組的核苷酸多樣性差異值分別為0.021 55、0.055 47和0.013 96，差異值均大于0.005，其中ⅠA和ⅠB組的核苷酸多樣性差異值均大于組Ⅱ，表明ⅠA和ⅠB組遺傳多樣性高于組Ⅱ。3個組的單體型多樣性差異值接近，均大于0.5，接近1，表現出較高的單體型多樣性?？傮w來看，核苷酸多樣性總體差異值為0.110 32（大于0.005），單體型多樣性差異值為0.998（大于0.5），說明3個組總體具有較高的核苷酸多樣性和單體型多樣性。

2.8 中性檢測分析

中性檢測結果顯示，3個組CP基因序列的Fu & Li’s D、Fu & Li’s F和Tajima’s D 3個參數檢驗值均小于0（表7），總體值也均為負值，表明 CMV群體處于擴張趨勢，群體在不斷擴張。

3 討論

CMV寄主范圍廣、地域適應性強，在與寄主植物互作過程中，相互協同進化，易發生變異。開展CMV群體遺傳多樣性研究，探明CMV的分子進化特征，對科學精準防控CMV意義重大。

據報道我國CMV分離物多為亞組Ⅰ（ⅠA、ⅠB），而亞組Ⅱ較少發現[24]。如宋麗云[8]對全國32個CMV分離物進行鑒定分析發現有18個屬于亞組Ⅰ。劉勇等[9]鑒定發現湖南煙區CMV株系主要為亞組Ⅰ，占比94.1%，但未細分出ⅠA和ⅠB。本研究對湖南煙草上CMV分離物的CP基因進行了序列分析并構建了系統發育樹，結果表明湖南CMV分離物均屬于亞組ⅠB，與劉勇、宋麗云等的研究結果一致。劉勇等[9]在云南和貴州煙草發現了少量的病毒樣品屬亞組Ⅱ，但本研究未發現湖南煙草上有亞組Ⅱ分離物，這可能與煙草品種差異或采樣的點還不全面有關。CMV的發生、進化和變異與不同寄主、地理位置、生長環境等因素有關，而且不同CMV亞組可能與其致病性強弱有關[25]，樣品陽性檢出率是否能夠反映CMV實際發生率，這些問題還有待進一步探究。另外，本研究僅基于CP基因進行系統分析，也有可能存在誤判，還需基于不同功能基因進一步分析。鑒于我國煙草上主要以CMV亞組ⅠB株系為主，故煙草CMV的抗病育種與防治應以亞組ⅠB株系為主要靶標，研究結果為煙草CMV的抗病品種選育提供了理論依據和支撐。

病毒豐富的遺傳多樣性主要來自基因重組、突變、基因流、遺傳漂變和自然選擇等因素長期相互作用[26]。推動病毒不斷進化的主要動力是基因重組[27]，它增強病毒適應新寄主和新環境的能力，進而擴大病毒的寄主范圍[28]。重組分析發現湖南煙草CMV CP基因無重組現象或重組現象不明顯，推測可能因為CMV不存在重組，以致煙草上CMV的發生一直比較穩定。遺傳漂變對病毒群體突變的頻率有重要作用，CMV存在ⅠA和ⅠB兩個相對獨立的群體，遺傳變異顯著，ⅠA和ⅠB之間的基因交流頻率較低。中國煙草CMV Ⅰ A主要與東亞的日本、韓國分離物親緣關系較近，相互交流頻率高，而Ⅰ B主要與東南亞的菲律賓、印度尼西亞交流較頻繁，與屬于亞組Ⅱ的歐洲、美國分離物之間交流頻率較低。推測中國煙草CMV起源有可能與煙草傳入中國的路徑相似，煙草攜帶CMV由日本和菲律賓南北兩條路徑傳入中國沿海，再傳入中國內地[29]，在現代煙草種植過程中，中國內地不同地區間攜帶CMV的煙草種子交流頻繁，導致CMV群體間同時存在遺傳差異和基因交流。

突變是驅動CMV進化的主要作用力之一[30]。選擇壓力和突變分析表明負選擇是CMV進化的主要驅動力，CMV CP基因序列變異較少，

遺傳結構相對比較穩定，這與趙雪君等[10]的研究結果相一致。遺傳多樣性參數（核苷酸多樣性和單體型多樣性）分析結果表明CMV群體遺傳多樣性較高，群組ⅠA和ⅠB遺傳多樣性高于Ⅱ，表明兩個群體相對穩定且長期演化，但群體之間呈現一定程度的分化，

整體處于擴張趨勢。群體內這種高遺傳多樣性的形成是一個長期過程，推測可能由于中國煙草種植區之間的種苗調運頻率較高，且CMV為重要的蚜傳病毒，經蚜蟲傳播導致不同地區和寄主間的CMV交流頻繁，易發生突變和自然選擇，從而造成不同群體的遺傳多樣性較高。

4 結論

對來自湖南煙草CMV 的CP基因進行了RT-PCR和測序，分析了湖南煙草CMV遺傳多樣性及分子進化機制，結果表明湖南煙草CMV屬亞組ⅠB，群體間地理相關性不明顯，無明顯重組現象，遺傳變異明顯，基因交流頻率低，遺傳多樣性較高，負選擇是驅動進化的主要作用力，種群處于擴張趨勢。本研究開展了CMV系統進化和遺傳多樣性分析，揭示了CMV分子變異進化特征，為CMV的抗病品種選育和病害精準防治提供了理論依據和科學指導。

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（責任編輯：楊明麗）