改進的QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬菜水果中百菌清及其代謝物殘留

畢瑞鋒, 鄧鎖成, 付 萌, 張偉偉, 張義霞

(1. 諾安實力可商品檢驗(青島)有限公司，山東 青島 266012；2. 梅里埃營養科學集團（中國） 研發部，山東 青島 266012)

百菌清是一種廣譜高效保護性殺菌劑，廣泛應用于水果、蔬菜、水稻等農作物種植過程中真菌性病害的防治。4-羥基百菌清是百菌清的主要代謝物，與百菌清母體相比，4-羥基百菌清的毒性更強[1]。鑒于百菌清對魚類和兩棲類動物有較高風險，且降解產物也可能對地下水有較高污染，自2019 年5 月20 日起，歐盟不再批準百菌清的再評審申請[2]。中國雖然批準百菌清在多種農作物上使用，但要求百菌清殘留量低于GB 2763—2021 規定的最大殘留限量 (MRL)[3]。與GB 2763—2021 規定的百菌清的殘留物定義不同，中國農業農村部規定在農藥登記殘留試驗和植物源性食品膳食風險評估時百菌清的殘留物定義為百菌清和4-羥基百菌清，即需要同時檢測百菌清和4-羥基百菌清。

百菌清的檢測方法主要有氣相色譜法[4-8]、氣相色譜-質譜法[9-12]、氣相色譜-串聯質譜法[13]；4-羥基百菌清的檢測方法主要是液相色譜-電噴霧離子源-串聯質譜法[6,8,14]。盡管目前已經有甲酯化衍生-氣相色譜法[15]、高效液相色譜法[16]和酶聯免疫法[17]等百菌清和4-羥基百菌清的同時檢測方法，但這些方法存在操作步驟繁瑣、靈敏度低和易受干擾等缺點，實際應用較少，迫切需要建立靈敏度高、專屬性好和操作簡便的可同時檢測百菌清和4-羥基百菌清的分析方法。大氣壓化學電離源(APCI) 可以實現百菌清分子的軟電離，李凌云等[18]采用液相色譜-大氣壓化學電離源-串聯質譜法建立了蔬菜中百菌清的檢測方法，不過該方法沒有解決百菌清在蕓薹屬類蔬菜中回收率低的問題。

QuEChERS 方法是近些年發展起來的農藥殘留檢測樣品前處理技術，具有操作簡便、分析速度快及溶劑用量少等諸多優點，適用于提取蔬菜水果中不同極性范圍的農藥殘留。采用QuEChERS方法提取百菌清時回收率往往偏低，這主要與pH值和基質種類有關。本研究以改進的QuEChERS技術作為前處理方法，采用配備APCI 源的高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜 (HPLC-MS/MS) 進行檢測，建立了蔬菜水果中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留的快速同時檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Sciex 6500 QTRAP 型HPLC-MS/MS 儀，配有APCI 源 (美國AB Sciex 公司)；旋渦混合器(德國IKA 公司)；Geno/Grinder 組織研磨機 (美國SPEX SamplePrep 公司)；X3R 型臺式離心機 (美國Thermo-Fisher 公司)；50 mL 聚丙烯離心管 (美國BD 公司) 。

百菌清(chlorothalonil，純度98.51%) 和4-羥基百菌清(chlorothalonil-4-hydroxy，純度99.0%)標準品 (德國Dr. Ehrenstorfer 公司)；乙腈和甲醇(HPLC 級，美國Merck 公司)；甲酸銨 (色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；乙酸 (分析純，美國Sigma 公司)；濃硫酸(分析純，煙臺遠東精細化工有限公司)；磷酸 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙酸鈉和氯化鈉 (分析純，江蘇強盛功能化學有限公司)；無水硫酸鎂 (分析純，西隴科學股份有限公司)；試驗用水為純凈水。

1.2 樣品前處理

準確稱取10 g (精確至0.01 g)經均質處理的新鮮蔬菜水果樣品，置于50 mL 離心管中，加入1 mL 10%硫酸溶液，渦旋混合1 min，加入10 mL乙腈，置于組織研磨機上劇烈振搖1 min。分別加入1 g 氯化鈉和4 g 無水硫酸鎂，立即搖散，再置于組織研磨機上劇烈振蕩1 min，然后以3 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm 尼龍濾膜，待測。

1.3 標準溶液配制及標準曲線繪制

百菌清標準儲備液：準確稱取10 mg (精確至0.01 mg) 百菌清標準品于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并且定容至刻度，于 -18 ℃避光保存。

4-羥基百菌清標準儲備液：準確稱取10 mg(精確至0.01 mg) 4-羥基百菌清標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并且定容至刻度，于 -18 ℃避光保存。

5 mg/L 標準工作溶液：移取適量標準儲備液，用體積分數為1%的硫酸-乙腈溶液配制成質量濃度為5 mg/L 的標準工作溶液，于4 ℃冰箱避光保存。標準工作溶液經28 d 的穩定性考察，百菌清和4-羥基百菌清的損失均小于10%，故將有效期定為28 d。

以結球甘藍空白樣品為例，按照1.2 節的方法提取樣品，得到空白基質溶液，用該空白基質溶液將標準工作溶液稀釋成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的系列基質匹配標準溶液，進行HPLC-MS/MS 分析，外標法定量。以百菌清和4-羥基百菌清的峰面積為縱坐標 (y)，質量濃度為橫坐標 (x)，繪制基質匹配標準曲線，權重選擇1/x。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex 色譜柱(100 mm × 2.1 mm，2.6 μm)；柱溫40 ℃；流動相A 為乙腈，B 為5.0 mmol/L 甲酸銨水溶液；流速0.7 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A；＞0.5～5.5 min，10% A～95% A；＞5.5～7.5 min，95% A；＞7.5～7.6 min，95% A～10% A；＞7.6～10.0 min，10% A。進樣量1 μL。

質譜條件：APCI 源；負離子掃描模式；多反應監測 (MRM) 模式；氣簾氣壓力1.38 × 105Pa；碰撞氣壓力6.21 × 104Pa；電暈針電流3 μA；蒸發溫度550 ℃；噴霧氣壓力3.45 × 105Pa。其他質譜參數見表1。

表1 百菌清及其代謝物的質譜參數Table 1 Mass parameters of chlorothalonil and its metabolite

2 結果與分析

2.1 質譜條件的建立

在APCI 負離子模式下，分別對百菌清和4-羥基百菌清標準溶液進行母離子掃描，未檢測到百菌清的準分子離子峰，但能檢測到比百菌清相對分子量小于19 u 的離子峰m/z244.9、m/z246.9和m/z248.9，同位素豐度比為3 : 3 : 1，根據此結果并結合文獻報道[18]，可以推測該離子峰是百菌清分子發生脫氯加氧親核取代反應后的產物離子[M-Cl + O]-，這與4-羥基百菌清掃描得到的準分子離子峰[M-H]-的質荷比及同位素豐度比一致，百菌清和4-羥基百菌清的母離子均為m/z244.9。

進行子離子模式掃描，在百菌清和4-羥基百菌清的二級質譜圖中，均得到m/z146.9、m/z174.9、m/z181.9 和m/z209.9 較強的碎片離子。推測m/z209.9 為母離子失去一個Cl 原子后的碎片離子，m/z174.9 為母離子失去兩個Cl 原子后的碎片離子，m/z181.9 為母離子失去一個Cl 原子和一個羰基后的碎片離子，m/z146.9 為母離子失去兩個Cl 原子和一個羰基后的碎片離子。對去簇電壓和碰撞能量進行優化，優化后的質譜參數見表1。在優化后的質譜條件下進行MRM 模式檢測，無論是百菌清還是4-羥基百菌清，均是m/z181.9 離子的響應最高，因此選擇m/z181.9 作為定量離子，剩余3 個響應較弱的離子m/z174.9、m/z209.9 和m/z146.9 作為定性離子，百菌清和4-羥基百菌清共用定量和定性離子通道。

2.2 色譜條件的建立

考察了甲醇-5 mmol/L 甲酸銨水溶液、乙腈-5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為流動相時百菌清和4-羥基百菌清的色譜行為和響應靈敏度。結果顯示：有機相無論采用甲醇還是乙腈，兩個目標分析物在色譜柱上均能獲得良好的保留和分離效果，采用乙腈時兩個目標分析物的響應更高，其中4-羥基百菌清的響應為采用甲醇時響應的兩倍以上；此外，采用乙腈時儀器系統壓力更低。綜上，最終選擇乙腈-5 mmol/L 甲酸銨水溶液作為流動相。優化后的百菌清及其代謝物的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 百菌清及其代謝物的MRM 色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of chlorothalonil and its metabolite

2.3 前處理方法的優化

百菌清在中性條件下穩定性較差，本研究發現：采用乙腈配制質量濃度為5 mg/L 的百菌清標準溶液，在4 ℃下放置36 h 后，百菌清的濃度降低23.4%，其中14.8%轉化為4-羥基百菌清。另有研究發現，采用同樣的前處理方式，結球甘藍、花椰菜等蕓薹屬類蔬菜基質中百菌清的添加回收率偏低[18]，不同樣品基質中百菌清的回收率不同。

為提高樣品提取過程中百菌清的穩定性和回收率，通常在樣品中加入硫酸[4]或者磷酸[5,16]，調節提取環境至酸性。本研究中，對傳統QuEChERS方法 (AOAC 2007.01) 的前處理步驟進行改進，用硫酸或者磷酸代替乙酸 (0.1 mL)/乙酸鈉 (1.5 g) 緩沖鹽。選擇結球甘藍作為樣品基質，比較了加入不同體積 (0.1、0.5 和1 mL) 10%硫酸或10%磷酸時目標分析物的回收率。為了對比改進效果，同時考察了不添加酸度調節劑和酸度調節劑為乙酸(0.1 mL)/乙酸鈉 (1.5 g) 緩沖鹽 (傳統QuEChERS方法) 時目標分析物的回收率?？疾鞎r添加水平為0.2 mg/kg，每處理重復3 次 (n=3) 。

結果 (圖2) 發現：1) 對于百菌清，當不添加酸度調節劑時，平均回收率只有10%左右；當添加乙酸/乙酸鈉緩沖鹽時，平均回收率比不添加酸度調節劑雖有所改善，但回收率和重復性仍比較差，表明傳統QuEChERS 方法不適用于結球甘藍中百菌清的檢測；采用10%硫酸溶液作為酸度調節劑，當添加量為0.1 mL 時，百菌清的平均回收率和重復性較差，當添加量大于0.5 mL 時，平均回收率提升到95%以上；采用10%磷酸溶液作為酸度調節劑，添加量為0.1 mL 時，百菌清平均回收率為78%，當添加量大于0.5 mL 時，平均回收率提升到95%以上。2) 對于4-羥基百菌清，不論采用何種酸度調節劑甚至不添加酸度調節劑，回收率都在88%～100%之間，說明酸度調節劑對4-羥基百菌清的回收率影響不大?？傊?，硫酸和磷酸均可作為酸度調節劑用于QuEChERS 方法檢測百菌清和4-羥基百菌清，考慮到QuEChERS 方法中已使用無機鹽硫酸鎂，故最終選擇以10%的硫酸為酸度調節劑，用量為1 mL。無論是在標準工作溶液貯存過程，還是結球甘藍樣品前處理過程，酸性環境中百菌清的穩定性和回收率均更好，因此在檢測其他基質樣品時均采用酸化乙腈進行提取。

圖2 酸度調節劑對目標分析物回收率的影響Fig. 2 Effect of acid regulators on the recoveries of the target analytes

與前人[4-5,16]的前處理方法相比，本研究采用酸化乙腈作為提取溶劑，避免了使用丙酮等不適合直接進行HPLC-MS/MS 分析的提取溶劑，同時省去了溶劑置換和凈化等步驟，試驗操作更加簡單。

2.4 方法的線性范圍和定量限

結果 (表2) 表明：百菌清及其代謝物在0.005～0.2 mg/L 范圍內線性關系良好，決定系數 (R2) 均大于0.99。選擇結球甘藍空白樣品，定量添加標準溶液，按照10 倍信噪比，則百菌清和4-羥基百菌清的定量限均為0.01 mg/kg。

表2 百菌清及其代謝物的線性方程、線性范圍、決定系數和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, R2 and LOQs for chlorothalonil and its metabolite

2.5 方法的正確度和精密度

向結球甘藍、黃瓜、葡萄和蘋果4 種基質空白樣品中分別添加0.01、0.05 和0.2 mg/kg 3 個水平的百菌清及其代謝物標準溶液，每個水平重復6 次。結果 (表3) 表明：百菌清的平均回收率為83%～104%，相對標準偏差 (RSD) 為1.0%～7.5%，4-羥基百菌清的平均回收率為83%～104%，RSD為0.73%～7.7%，方法的正確度和精密度均滿足要求[19]。

表3 百菌清及其代謝物在4 種基質中的添加回收率和相對標準偏差 (n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of chlorothalonil and its metabolite spiked in the four matrices (n=6)

2.6 基質效應

通過比較結球甘藍、黃瓜、葡萄和蘋果空白基質匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率，對基質效應 (Me) 進行評價。當|Me|＜20%時可忽略不計；當|Me|＞20%時表示存在基質效應，需采用基質匹配標準校正法等方式對基質效應進行校正[20]。本研究表明，百菌清及其代謝物在4 種樣品基質中的|Me|值均小于20%，基質效應可忽略，不過為了獲得更準確的方法學回收率數據，仍采用基質匹配標準校正法建立工作曲線。

2.7 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對26 份送至本實驗室的蔬菜水果樣品進行檢測。結果顯示：分別有1 份草莓樣品、1 份蘋果樣品和1 份番茄樣品檢出百菌清，含量分別為0.031、0.015 和0.018 mg/kg；所有樣品均未檢出4-羥基百菌清。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規定，草莓、蘋果和番茄中百菌清的MRL 值分別為5、1 和5 mg/kg[3]，根據該標準，本研究所檢樣品中百菌清的殘留量均未超標。

3 結論

采用改進的QuEChERS 方法結合APCI 離子化的高效液相色譜-串聯質譜儀，建立了同時測定蔬菜水果中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留的方法。本方法具有簡單快速、準確度高、實用性強等優點。與文獻方法[18]相比，本研究解決了百菌清在標準品儲存環節和樣品前處理過程中易降解的問題，極大提高了方法的可靠性，不僅為開展百菌清的農藥登記殘留試驗和膳食風險評估提供了技術支持，也為蔬菜水果中百菌清的常規監控提供了一種快速手段。