血清ANRIL和miR-122在隱匿性乙型肝炎病毒感染中的表達關系研究

李想 王妍柏 王銀鋒 黃學蘭

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的疾病，具有傳染性、流行性等特征[1]。血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性是HBV感染的重要依據，但部分患者血清HBsAg檢測為陰性，但肝臟組織或血清中HBV DNA檢測為陽性，此部分患者稱為隱匿性HBV感染患者[2]。隱匿性乙型肝炎目前仍缺乏早期診斷標志物，嚴重威脅人類生命健康。研究表明，微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)在乙型肝炎的發生發展及HBV復制過程中呈異常表達[3]。細胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 Locus，ANRIL)屬于長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)的一種，是多種疾病的易感位點，研究表明，miR-122是ANRIL的靶基因之一[4]。因此，本研究對隱匿性乙型肝炎等患者血清ANRIL、miR-122進行檢測，結合臨床指標分析探討ANRIL、miR-122對隱匿性乙型肝炎的鑒別診斷價值，以期為臨床上開發早期隱匿性乙型肝炎診斷指標提供新思路。

資料與方法

一、一般資料

選取2019年2月至2021年1月寧夏醫科大學總醫院感染科收治的20例隱匿性乙型肝炎患者為隱匿性乙型肝炎組，平均年齡(46.95±10.02)歲；選取同期住院治療的80例慢性乙型肝炎患者作為慢性乙型肝炎組，平均年齡(47.22±10.13)歲；另同期選取80例健康體檢者作為健康對照組，平均年齡(46.83±9.48)歲。

納入標準：①慢性乙型肝炎診斷符合相應指南[5]，隱匿性乙型肝炎診斷符合診斷標準[6]；②年齡≥20歲，病例資料齊全者；③一個月內未使用免疫抑制劑、抗炎藥物者；④試驗符合倫理學標準，患者均自愿參加。排除標準：①有結核病、酒精性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病者；②有免疫缺陷病毒或其他病毒感染者；③有肝硬化跡象者。

查閱門診及住院病歷，收集整理患者年齡、性別、體質指數(body mass index，BMI)等一般資料。

二、主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(貨號：JL1545)購自德國QIAGEN公司；反轉錄試劑盒(貨號：YT9036)購自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(貨號：RR820A)購自日本Takara公司；HBV核酸定量檢測試劑盒(貨號：QMTEZ-7147)購自上海圻明生物科技有限公司。qRT-PCR儀(型號：Stratagene Mx3005P)購自上海普迪生物科技有限公司；酶標儀(型號：Infinite F50)購自奧地利Tecan公司；全自動生化分析儀(型號：YSI 2950)購自瑞士INFORS公司。

三、研究方法

(一)樣品采集及保存 采集健康體檢者體檢當天及慢性乙型肝炎和隱匿性乙型肝炎患者入院第二天清晨空腹靜脈血，離心后收集血清，-80℃保存。

(二)血清ANRIL、miR-122水平測定 采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測受試者血清ANRIL、miR-122表達水平。采用試劑盒提取血清總RNA并反轉錄得cDNA。采用qRT-PCR儀擴增ANRIL、miR-122及其內參基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，序列見表1。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環。每個樣品重復3次，采用2-△△CT法計算血清ANRIL、miR-122相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

(三)血清TBil、ALT、AST水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清總膽紅素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine transarninase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，操作步驟嚴格按照儀器使用說明書進行。

(四)HBV DNA載量檢測 采用PCR結合熒光探針的體外DNA擴增技術檢測血清HBV DNA載量。HBV引物序列及熒光探針序列見表2，引物及探針由中山醫科大學達安基因診斷中心合成。DNA提取后，依照HBV核酸定量檢測試劑盒(PCR結合熒光探針的體外DNA擴增技術)說明書進行操作，之后放入qRT-PCR儀進行擴增。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火1 min，40個循環。反應結束后電腦分析計算HBV DNA拷貝數。

表2 HBV引物及熒光探針序列

四、統計學分析

結 果

一、健康對照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組一般資料比較

健康對照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組年齡、性別、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；慢性乙型肝炎組TBil、ALT、AST水平高于隱匿性乙型肝炎組和健康對照組，HBV DNA載量高于隱匿性乙型肝炎組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 健康對照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組一般資料比較[n，(±s)]

二、健康對照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL、miR-122比較

慢性乙型肝炎組血清ANRIL高于隱匿性乙型肝炎組和健康對照組，miR-122低于隱匿性乙型肝炎組和健康對照組；隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL高于健康對照組，miR-122低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 健康對照組、慢性乙型肝炎組和隱匿性乙型肝炎組血清ANRIL、miR-122比較(±s)

三、隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量的相關性

Pearson法分析結果顯示，隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL與miR-122呈負相關(r=-0.597，P<0.05)，且ANRIL與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量均呈正相關(P<0.05)；miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量均呈負相關(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL與miR-122的相關性

表5 隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL、miR-122與TBil、ALT、AST、HBV DNA載量的相關性

四、血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的價值

以血清ANRIL、miR-122水平為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.901(95%CI: 0.796～0.996)、0.887(95%CI: 0.822～0.953)，截斷值分別為1.218、0.847，特異度分別為91.2%、73.8%，敏感度分別為85.0%、95.0%；二者聯合鑒別診斷的AUC為0.941(95%CI: 0.868～0.998)，特異度為96.3%，敏感度為90.0%。見圖2。

圖2 血清ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的ROC曲線

五、影響隱匿性乙型肝炎發生的多因素Logistic回歸分析

將是否發生隱匿性乙型肝炎作為因變量，以ANRIL、miR-122、TBil、ALT、AST、HBV DNA載量為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示ANRIL是影響隱匿性乙型肝炎發生的獨立危險因素(P<0.05)，miR-122是影響隱匿性乙型肝炎發生的保護因素(P<0.05)。見表6。

表6 影響隱匿性乙型肝炎發生的多因素Logistic回歸分析

討 論

關于引起隱匿性乙型肝炎的原因，目前尚無統一觀點，但仍可確認隱匿性乙型肝炎是病毒(如突變或病毒DNA整合到宿主基因組中)和宿主(如長期的HBV特異性T細胞的免疫反應或免疫系統紊亂)共同作用的結果[7]。目前在隱匿性乙型肝炎個體中，即使是檢測“金標準”——檢測HBV DNA載量的方法也存在一定局限性，因其血清HBV DNA含量通常較低，有時甚至無法用當前的技術手段檢測到，因此可能出現假陰性的結果[8]。隱匿性乙型肝炎患者體內病毒仍處于低復制狀態，會加速患者肝臟疾病進展，威脅器官移植、輸血等的安全性[9]。

lncRNA是由基因組中非編碼序列轉錄生成的，其長度大于200 nt且不具有翻譯成蛋白質能力，許多lncRNA在表觀遺傳、翻譯及蛋白修飾過程中均可發揮重要的調控作用[10]。ANRIL作為一種lncRNA，其在包括肝癌在內的多種腫瘤中發揮重要的致癌基因作用[11]。Ma等[12]研究證實，ANRIL可調節肝癌細胞增殖和細胞周期發展。miR-122在肝臟發育、脂質代謝、肝癌細胞的發生發展等過程中均發揮重要調控作用，可作為肝臟特異性表達指標[13]。荊曉晴等[14]研究顯示，HBV攜帶者外周血單核細胞中miR-122表達異常，且可能與病毒增殖有關。本研究結果顯示，隱匿性乙型肝炎患者及慢性乙型肝炎患者血清中ANRIL表達水平升高，miR-122表達水平降低，且隱匿性乙型肝炎患者中二者與HBV DNA載量均呈一定的相關性，miR-122表達趨勢與徐蘭鋒等[15]及馬青松等[16]研究結果一致，提示ANRIL的高表達、miR-122的低表達可能與肝炎的發生發展有關。Ma等[17]研究表明，ANRIL可通過調節miR-122的表達調節肝癌細胞的增殖、轉移和侵襲。本研究推測ANRIL可能通過靶向調節miR-122轉錄，使其表達水平降低，進而影響HBV復制活動，調控乙肝病情的發生發展。進一步采用多因素Logistic回歸分析，結果顯示ANRIL、miR-122均是影響隱匿性乙型肝炎發生的因素。進一步驗證了ANRIL、miR-122在隱匿性HBV復制及病情進展中的作用。本研究采用ROC曲線分析了ANRIL、miR-122在隱匿性乙型肝炎中的鑒別診斷效能，結果表明ANRIL、miR-122鑒別診斷隱匿性乙型肝炎的最佳截斷值分別為1.218、0.847，兩指標均有較高的診斷效能，且二者聯合后的診斷特異度為96.3%，均高于二者單獨檢測(分別為91.2%、73.8%)。此外，本研究中血清ANRIL、miR-122與肝功能指標TBil、ALT、AST均有相關性，這提示ANRIL、miR-122可能通過影響HBV復制，加速隱匿性乙型肝炎患者病情進展，造成其肝功能損傷。

綜上所述，隱匿性乙型肝炎患者血清ANRIL表達水平升高，miR-122表達水平降低，二者均與HBV DNA載量有關，且在鑒別診斷隱匿性乙型肝炎中有較高的診斷效能。ANRIL、miR-122可能通過影響HBV復制參與隱匿性乙型肝炎的發生、發展。ANRIL、miR-122可能有較高的應用價值，值得臨床醫師關注，但因本研究收集病例數有限，結果可能存在一定的局限性，且具體機制尚需進一步通過動物模型實驗證實。