水網藻生長及鈾對其生長影響的模型構建

張建國 羅學剛

(1. 西南科技大學生命科學與工程學院 四川綿陽 621010； 2. 西南科技大學環境與資源學院 四川綿陽 621010)

核能的廣泛應用、鈾礦的開采以及鈾尾礦維護過程形成了不同賦存形態的含鈾廢水。含鈾廢水的環境泄露會損害身體健康、威脅生命安全。因此，對含鈾廢水的治理備受關注[1-3]。鈾的形態不僅與環境化學組成有關，也與pH值關系密切，鈾在堿性水體條件下主要以UO2(CO3)22-，UO2(OH)3-等陰離子形態存在[4-6]，而在酸性條件下主要以UO22+，(UO2)3(OH)5+等陽離子形態存在[7-8]。目前，含鈾廢水的治理研究主要集中在物理化學和生物技術方法方面。生物富集是生物技術方法中的一種重要方式。已有大量文獻報道了有關活體生物進行鈾富集的研究成果，但關于堿性條件下鈾的富集報道較少[1]。具有富集堿性水體鈾的生物篩選有利于拓寬生物修復應用范圍。水網藻(Hydrodictyonreticulatum)是一種少見的大型網片狀能自由漂浮的淡水綠藻，具備容易采集的特征。水網藻對營養要求低且生境廣泛，便于大規模培養，能廉價獲得以滿足應用需求。已有文獻報道水網藻對重金屬污染水體有著較強的重金屬富集能力、耐受能力及良好的凈化效果[9-10]。1988年Rybova等[11]研究了鉈離子與水網藻的吸收交換；Gao等[12]研究發現水網藻對鉛離子具有很好的富集能力，每千克干重可以富集4 000 mg；林秋奇研究發現水網藻對Pb2+，Fe3+，Cd2+等重金屬有著良好的富集能力[13]。雖然水網藻在重金屬富集方面有著良好的開發前景[14]，但水網藻對鈾的富集研究鮮見報道。雖然作者在前期研究過程中發現水網藻對鈾具有良好的生物富集能力，但對其富集機制了解不足。生物富集重金屬與其生理活性關系密切，生理活性又與其培養條件和培養基組分關系密切，當培養基組分存在差異時往往會引起培養最優條件的差異從而導致細胞生理活性的差異[15]。生長動力學是描述生物細胞代謝活性的一種重要方式，也是機理分析的重要手段。本文基于BG11培養基優化水網藻生長條件，了解水網藻生長和培養條件的關系；假設水網藻生長過程受到自身抑制，構建其生長動力學模型，分析其抑制機理；構建鈾脅迫對水網藻生長影響的模型，表征鈾濃度對水網藻生長影響規律。本研究可為水網藻富集鈾的生理機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源和預培養

供試水網藻采集自湖南省衡陽市某鈾尾礦廢水溝渠中，經分離純化獲得。將純化的水網藻接入含有BG11新鮮培養基的玻璃容器中, 將玻璃容器置于人工氣候培養箱 (MGC-1500HP-2, 上海一恒科學儀器有限公司)中進行單種預培養。設定溫度為25 ℃，光照強度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養時間約7 d。當水網藻長度為2～5 cm時即可作為種子。

1.1.2 鈾儲備液

稱取一定質量硝酸鈾酰(238U，UO2(NO3)2·6H2O，分析純，西安鼎天化工有限公司)溶解于去離子水，適當稀釋后用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS, Agilent 7700x, Agilent Technologies, Ltd., USA)測定U的質量濃度，然后將其稀釋調節為5 000 mg/L作為U儲備液。根據實驗要求利用鈾儲備液進行調節至目標濃度。

1.1.3 BG11培養基組分

90 mg/L NaNO3, 16 mg/L K2HPO4·3H2O,75 mg/L MgSO4·7H2O, 36 mg/L CaCl2·2H2O, 20 mg/L Na2CO3, 25 mg/L NaCl, 5 mg/L FeSO4·7H2O, 31 mg/L KOH 以及 1 mL/L 微量元素 (2.86 g/L H3BO3, 1.81 g/L MnCl2·4H2O, 0.222 g/L ZnSO4·7H2O, 0.39 g/L Na2MoO4, 0.079 g/L CuSO4·5H2O, 0.049 4 g/L CoNO3·6H2O)，pH值 8.35。所有試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養條件對水網藻生長的影響

每個300 mL的植物組織培養瓶中裝入100 mL BG11培養液，每瓶接入濕重為0.20±0.01 g的水網藻，置于人工氣候培養箱中進行培養。設定溫度為25 ℃，光照強度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，pH值8.35，分別按照以下因素梯度進行單因素試驗：

(1) 溫度梯度：10，15，20，25，30 ℃；

(2) 光照強度梯度：2 500，3 000，3 500，4 000，5 000 lx；

(3) pH值梯度： 5.98，7.01，8.01，9.04，9.98。

每個梯度試驗5次以上重復，培養至48 h和72 h 時，測定水網藻濕重并計算其比生長速率和溫度Q10(Q10表示溫度每升高10 ℃比生長速率增加的系數)，即Q10=(μ2/μ1)10/(T2-T1)，T和μ分別表示溫度和比生長速率且T2>T1。

1.2.2 水網藻生長動力學模型構建

每個300 mL的植物組織培養瓶中裝入100 mL BG11培養液，每瓶接入濕重為0.20±0.01 g的水網藻。置于人工氣候培養箱中進行培養。設定溫度為25 ℃，光照強度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養18 d，間隔2 d稱其鮮重，并換算為干重。假設：(1) 水網藻在生長過程中營養物質滿足且不對水網藻的生長產生底物抑制；(2) 無水網藻自身分泌物的抑制；(3) 存在自身生長過程由于爭奪生存空間而產生抑制。根據假設獲得方程(1)：

(1)

式中：Cx為干水網藻質量濃度(mg/L)；t為培養時間(h)；μmax為最大比生長速率；Cx,max為干水網藻最大質量濃度(mg/L)。

1.2.3 鈾對水網藻生長的影響

每個300 mL的植物組織培養瓶中裝入100 mL BG11培養液，調節鈾質量濃度分別為0 ，1，2 ，3，4 ，5，10，20，30 mg/L，然后每瓶接入濕重為0.20±0.01 g 的水網藻，置于人工氣候培養箱中進行培養。設定溫度為25 ℃，光照強度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養28 h。分別于0 ，28 h稱其鮮重，并換算為干重，計算0～28 h間水網藻的比生長速率。每個濃度梯度5次重復，取其平均值且相對誤差小于10%。

1.2.4 水網藻干重與濕重的關系及比生長速率計算方法

利用吸水紙吸走鮮活的水網藻表面水分，隨機分成質量不等10份，烘干至恒重，以濕重為橫坐標、對應的干重為縱坐標作圖，擬合曲線得到干重與濕重標準曲線，mdry= 0.0128+0.2268mwet(R2=0.9987)。mdry表示水網藻干重(mg)，mwet表示水網藻濕重(mg)。

比生長速率：μ=ln(mt/m0)/t

其中:mt為時間t時水網藻的質量(mg),m0為起始時水網藻的質量(mg)，t為間隔時間h。

生長代時：tG=ln2/μ。

1.2.5 數據處理

未特殊說明平行試驗為3次重復，取其平均值，標準偏差小于5%。使用Excel 2007進行數據處理后，使用SPSS 20.0軟件工具進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 溫度對水網藻生長的影響

水網藻比生長速率與溫度關系如圖1所示。水網藻生長的最適溫度為25 ℃，比生長速率為0.193 1 g·g-1·d-1。當培養溫度低于25 ℃時，比生長速率與溫度(T)關系服從μ=0.0087T-0.0219 (R2=0.9874，P<0 .05)，可見水網藻在高于2.6 ℃ 溫度環境就可生長，與文獻[15]報道的4 ℃ 有偏差，但比較接近。2.6 ℃ 至25 ℃ 水網藻生長溫度Q10值為 2.38(Q10表示溫度每升高10 ℃，比生長速率增加的系數，可以用來描述溫度對水網藻的生長影響程度,Q10越高,說明溫度對水網藻生長影響越大)。一般藻類(10～20 ℃)Q10為1.8～3.5[16]。王朝暉等[15]和Hawes等[3]報道了水網藻在不同條件下Q10分別為 2.86和3.50，說明本實驗條件下水網藻對溫度的敏感度降低，但也可能與藻種有關。當溫度超過25 ℃ 時，根據兩點法可以推測水網藻停止生長的上限溫度為38 ℃，略低于文獻[13]報道的40 ℃。由此可見，水網藻能在較為寬泛的溫度條件下生長，最適溫度為25 ℃，尤其適合鈾尾礦豐富的南方水體，為水網藻用于鈾尾礦修復提供了有利條件。

圖1 水網藻不同溫度條件下的比生長速率Fig.1 Specific growth rate of H. reticulatum under different temperatures

2.2 pH值對水網藻生長的影響

pH值對水網藻比生長速率的影響見圖2。從圖2可以看出，水網藻適合于堿性條件生長，雖然水網藻在pH值6時也能夠較好生長但其比生長速率顯著低于pH值7～10時的比生長速率(P<0.05), pH值9時水網藻的比生長速率明顯高于其他pH值條件下的比生長速率(P<0.05)，說明水網藻最適pH值為9。通過圖2可以得知水網藻生長pH值跨度寬泛，便于培養，適合堿性條件下鈾的富集。

圖2 水網藻在不同pH值條件下的比生長速率Fig.2 Specific growth rate of H. reticulatum under different pH values

2.3 光照強度對水網藻生長的影響

不同光照強度對水網藻生長速率的影響結果如圖3所示。從圖3可以看出，在光照強度為2 500 lx時, 水網藻雖能較好生長，但比生長速率顯著低于3 000～5 000 lx光照強度下的比生長速率。 3 000～ 5 000 lx光照強度下，水網藻比生長速率差異不顯著，說明在25 ℃時,水網藻的光飽和點在3 000 lx 以上。Hawes等[3]和王朝暉等[15]的研究結果分別表明水網藻的光飽和點為3 000 lx和6 800 lx。光飽和點的差異，一方面和水網藻藻種差異有關，另一方面與溫度有關。當溫度較高時，代謝加快，不能及時通過光照獲得物質補給與能量供給，可能會導致水網藻生長減緩甚至負增長[15]。不過，Raven 等[17]研究表明新西蘭水網藻和非洲水網藻對光強要求不太高, 均適合于弱光環境，認為水網藻趨向于陰生性。

圖3 水網藻不同光照強度條件下的比生長速率Fig.3 Specific growth rate of H. reticulatum under different light intensities

2.4 水網藻生長動力學模型

將式(1)按照張建國等[18]方法進行積分，獲得方程(2)：

(2)

將實驗數據帶入式(2)進行非線性擬合獲得水網藻生長動力學參數Cx,0，Cx,max，μmax分別為64.573 2，621.427 1，0.016 4，再帶入式(2)獲得水網藻生長動力學方程(3)：

(3)

利用式(3)獲得模型預測值并與實驗值比較進行模型驗證，結果見圖4。從圖4可以看出，模型可以較好模擬水網藻的生長，準確度可達85.51%以上。

圖4 水網藻生長動力學模型及其驗證Fig.4 Growth kinetics model and its verification of H. reticulatum

從圖4可以看出，水網藻生長過程中會受到自身生長空間爭奪，導致相互抑制。當干水網藻質量濃度為621.427 1 mg/L時，水網藻生物量增加緩慢甚至不增加，稱為水網藻最大生長抑制濃度，可為水網藻的后期研究方案設計提供參考。假設水網藻沒有抑制時，最大比生長速率為0.016 4 g·g-1·h-1，計算獲得其代時為42.5 h。

2.5 鈾對水網藻生長的影響模型

將0～28 h水網藻的平均比生長速率與對應鈾脅迫濃度作圖，如圖5所示。由圖5可以看出，隨著鈾濃度增長，水網藻的比生長速率呈現先升高后降低的拋物線形式，可見鈾對水網藻生長的影響呈現“低促高抑”的生物學效應[19]?？梢哉J為水網藻對鈾的脅迫響應過程由3個部分組成：第一部分是無鈾脅迫時的比生長速率P0; 第二部分是低濃度鈾(x)促進的比生長速率函數S(x)；第三部分是高濃度鈾(x)抑制的比生長速率函數I(x)?；形镔|誘導的低促高抑現象被稱為赫米斯(Hormesis)現象，常用式(4)表達[20-21]：

P(x)=P0+S(x)-I(x)

(4)

雖然鈾作為重金屬并非化感物質，但是呈現出相同的變化趨勢，因而在形式上可以采用該方程進行描述。米氏專門構建了米氏方程(Mitscherlich model)用以描述限制因子影響生物生長的數學模型：

μ=μmax(1-exp(-c·f(i)))

(5)

式中：μ為生長比速；i為限制性因子；μmax為最大比生長速度；c為常數；f(i)為關于i的函數。

鈾對水網藻生長的影響與化感物質對生物體生長的影響在本質上都與酶的活性表達或活性抑制有關, 將米氏方程(5) 引入方程(4)中的S(x)和I(x)就可以賦予方程(4)具有酶促反應的生物學特征[22]。

Hormesis模型中引入米氏(Mitscherlich)因子后的模型描述如下：

P(x)=P0+Smax(1-exp(-ks·x))-

Imax(1-exp(-ki·x))

(6)

將P0設置為對照值，即P0=0.0066，采用最小二乘法進行非線性曲線擬合獲得模型參數代入方程(6)，得到描述鈾對水網藻脅迫呈現的“低促高抑”方程(7)。

m=0.0066+0.0187(1-exp(-0.9563CU))-

0.0215(1-exp(-0.2978CU))

(7)

式中CU表示鈾的質量濃度(mg/L)。

將模型預測值(如圖5中紅線所示)與實驗值進行比較得到的相關系數為 0.991 4，說明該模型能夠較好地擬合實驗值。

圖5 鈾脅迫下的水網藻比生長速率模型Fig.5 Specific growth rate model of H. reticulatum under uranium stress

3 結論

(1)水網藻具有2.6～38 ℃ 的模型生長溫度，最適溫度為25 ℃，能夠適合我國南方水體鈾的富集；pH值 6～10水網藻都能較好生長，且pH值 9時最適生長，水網藻適合用于堿性條件下含鈾廢水的富集。

(2)水網藻的生長存在藻間的相互抑制，可利用生長競爭模型描述，最大比速為0.016 4 g·g-1·h-1，最小代時為42.5 h。

(3)Hormesis模型中引入米氏(Mitscherlich)因子能夠描述鈾脅迫下水網藻呈現的“低促高抑”現象。