刺玫果不同醇提物對降糖酶活性影響及其加工穩定性

符 群，吳小杰

（1.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江省植物資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

刺玫果Rosa davurica也被稱為野薔薇果、玫瑰果，為薔薇科Rosaceae 薔薇屬Rosa植物，資源產量豐富，在內蒙古、東北和山東沿海地區大量生長，一般集中在海拔1 000～1 750 m 之間的陽坡和陰坡[1]。刺玫果果肉加熱后口感甘甜，可制作果醬、復合飲料等產品，含有多種功效成分，市場前景廣闊。研究發現刺玫果的有效成分主要包括黃酮類、多酚類、皂苷類、多糖類、單寧類等化合物，其中研究最多的是黃酮類化合物。作為一種藥食同源的食源性植物，刺玫果具有很高的營養及藥用價值，通過精深加工，可獲得較高附加值的產品，具有抗衰老、預防心腦血管疾病、免疫調節、抗疲勞、降血脂血糖等功能[2]，《中藥大詞典》[3]中記載其具有健脾調氣、養血調經的功效。

糖尿病是一種由遺傳、環境等因素引起的以持續性高血糖為特征的代謝性疾病[4]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶可水解α糖苷鍵、α螺旋式直鏈淀粉為葡萄糖、麥芽糖等，促進小腸消化吸收，進而引起餐后血糖水平升高[5]，因此抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性可有效調節高血糖。目前，市面降糖藥物多為合成類降糖藥物，一些天然產物類降糖劑可通過改變α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的構象，導致催化活性降低，并具有無毒副作用、來源廣泛且療效穩定的獨特優勢，越來越受到研究者的關注與社會的重視[6]。

刺玫果活性成分性質不穩定，除受自身結構的影響外，不同加工和儲藏因素也會不同程度地降解、氧化或聚合成新物質而改變其性質，導致其生物活性降低、穩定性難以控制[7]，限制了刺玫果在精深度加工中的應用。

目前刺玫果正在作為一種天然保健藥物被日益重視和廣泛開發，而關于刺玫果抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性以及活性成分穩定性方面的報道較少。本研究從不同體積分數乙醇提取入手，初步測定刺玫果中主要活性成分及其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用，通過研究溫度、光照、pH 值和金屬離子等常見食品加工條件對其穩定性的影響，以期為刺玫果的加工保藏以及進一步開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

刺玫果鮮果：黑龍江省蘿北縣林業局提供。

試劑：α-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、α-淀粉酶（5 000 U/g）、沒食子酸標準品（≥98%）、蘆丁標準品（≥98%）、阿卡波糖：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、Al(NO3)3、NaOH、Na2CO3等均為國產分析純。

1.2 主要儀器

T6 新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；酶標分析儀（EPOCH12）：BioTek Instruments，Inc；紫外輻射儀（北京五環通達科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺玫果不同醇提物制備

鮮刺玫果清洗去雜，40℃烘干粉碎，過60目篩，按質量體積比1∶2 條件，石油醚浸泡2 h，按質量體積比1∶10 條件分別加入30%、50%、70%、90%乙醇，80℃水浴浸提2 h，減壓抽濾，收集濾液，濾渣再次浸提，合并兩次提取液，真空濃縮得乙醇提取物，冷凍干燥，-20℃保存備用。

1.3.2 刺玫果不同醇提物主要活性成分含量分析

1）黃酮含量測定

稱取蘆丁標準品0.005 g，60%乙醇定容于25 mL 容量瓶中，準確吸取不同濃度蘆丁標準品于10 mL 具塞試管，分別加5% NaNO2溶液0.3 mL，放置6 min，加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，放置6 min，加入10% NaOH 溶液4 mL，補水至刻度線，搖勻放置15 min，以等量蒸餾水按同樣顯色操作為空白，于510 nm 處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為X 軸，吸光度為Y 軸繪制標準曲線[8-9]：y=6.88x-0.004 7，R2=0.999 1。按式(1)計算醇提物黃酮含量。

式（1）中：C1為樣液黃酮質量濃度（mg/mL）；V1為樣液體積（mL）；N1為稀釋倍數；M1為樣品質量（g）。

2）多酚含量測定

稱取0.025 g 沒食子酸標準品，60%乙醇定容至25 mL 容量瓶，吸取不同濃度標品溶液于25 mL 容量瓶并定容。吸取0.5 mL 稀釋液，加2.5 mL 10%福林酚試劑、7 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻避光反應30 min，以等量蒸餾水按同樣顯色操作為空白，于760 nm 處測定吸光值，以沒食子酸濃度（mg/mL）為X 軸，吸光度為Y 軸繪制標準曲線[10]：y=0.069x+0.001 7，R2=0.999 1，按式(2)計算醇提物多酚含量。

式（2）中：C2為樣液總酚質量濃度（mg/mL）；V2為樣液體積（mL）；N2為稀釋倍數；M2為樣品質量（g）。

3）多糖含量測定

稱取無水葡萄糖對照品0.002 5 g定容于250 mL容量瓶，取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 并補水至2.0 mL，加6%苯酚溶液1 mL，搖勻，貼壁緩慢加入濃硫酸5 mL，搖勻放置10 min，于40℃水浴15 min 后冷卻至室溫，以等量蒸餾水按同樣顯色操作為空白，于490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度（mg/mL）為X 軸，吸光度為Y 軸繪制標準曲線[11]：y=0.296 6x+0.006 2，R2=0.999，按式(3)計算醇提物多糖含量。

式（3）中：C3為樣液多糖濃度（mg/mL）；V3為樣液體積（mL）；N3為稀釋倍數；M3為樣品質量（g）。

1.3.3 酶活性抑制率的測定

1.3.3.1α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定

取配置好的樣品溶液100 μL 于96 孔板，加0.5 mg/mL 的PNPG 溶液40 μL，pH 值為6.8 的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液50 μL，37℃水浴10 min，加入10 μL 2 800 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，37℃孵育20 min 后，加入0.2 mol/L 的Na2CO3溶液40 μL終止反應，震蕩混合均勻，于405 nm 波長處測定吸光度[12-13]，按公式(4)計算抑制率：

式（4）中：Ab為待測液與酶反應的吸光度；Ac為只有待測液反應的吸光度；Ad為等量磷酸鹽緩沖溶液與酶反應的吸光度；Ae為只有磷酸鹽緩沖溶液反應的吸光度。

1.3.3.2α-淀粉酶的抑制活性測定

取配置好的樣品溶液80 μL 于96 孔板中，加入0.1%可溶性淀粉20 μL，10 U/mLα-淀粉酶溶液20 μL，震蕩混合均勻，在37℃條件下孵育10 min 使酶活化，加入0.4 mol/L HCl 50 μL，I2（KI）溶液70 μL 終止反應，于600 nm 波長處測定吸光度[14]，按公式(5)計算抑制率：

式（5）中：Ai為待測液與酶反應的吸光度；Aj為只有待測液反應的吸光度；Al為等量磷酸鹽緩沖溶液與酶反應的吸光度；Am為只有磷酸鹽緩沖溶液反應的吸光度。

兩種酶的活性抑制實驗均以阿卡波糖作為陽性對照，制作標準曲線。

1.3.4 刺玫果醇提物穩定性研究

對降糖酶抑制效果較好的刺玫果醇提物進行加工穩定性研究，分別考察以下4 因素：（1）溫度的影響：將醇提液分別置于30、50、70、90℃條件下避光保溫2 h。（2）光照影響：醇提液置于室內自然光照下5 天，每隔1 天取樣測定；50 w 紫外光照（320～400 nm）下60 min，每隔10 min 取樣測定。（3）pH 值的影響：使用pH 值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 的溶液配制刺玫果提取物溶液。（4）金屬離子的影響：使用濃 度 為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L 的Na+、K+、Mg2+、Cu2+配置一定質量濃度的醇提液，室溫靜置2 h。分別在以上不同因素條件下測定刺玫果醇提物黃酮、多酚以及多糖含量[15-16]，并分析刺玫果醇提物穩定性的變化。

1.4 數據處理

采用Excel 2016、Origin 8.6 軟件進行數據分析及繪圖、SPSS 20.0 軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 刺玫果不同醇提物對降糖酶活性的抑制作用

碳水化合物水解為葡萄糖的關鍵酶是以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶為主，提高這兩種酶的抑制率，減少水解淀粉和低聚糖含量，將有助于降低餐后高血糖水平[17]。如圖1所示，刺玫果醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以阿卡波糖為對照（IC50為0.12 mg/mL），醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率表現為70%（IC50為1.91 mg/mL）＞50%（IC50為2.46 mg/mL）＞30%（IC50為2.64 mg/mL）＞90%（IC50為3.05 mg/mL）。刺玫果醇提物對α-淀粉酶抑制率均呈現逐漸上升的線性關系，70%醇提物抑制α-淀粉酶的IC50值（10.561 mg/mL）略低于50%的IC50值（10.212 mg/mL），與刺玫果醇提物對α-葡萄糖苷酶活性影響相比，醇提物對α-淀粉酶的抑制活性較弱，可能是刺玫果醇提物結構中具有更有利于與α-葡萄糖苷酶活性位點結合的基團，而抑制α-淀粉酶時，這種優勢似乎不是特別明顯[18]。

表1 刺玫果不同醇提物的主要活性活性成分含量?Table 1 Content of main active components in different alcohol extracts of Rosa davurica mg·g-1

圖1 刺玫果不同醇提物對降糖酶活性的影響Fig.1 Effects of different Rosa davurica alcohol extracts on the activity of hypoglycemic enzymes

楊文娟等[19]用70%乙醇回流提取得到醇提物有一定的抗α-葡萄糖苷酶活性。劉燕[20]以不同濃度乙醇提取得到的細葉韭花中有效成分與α-葡萄糖苷酶抑制作用之間具有良好的線性關系。與相似研究對比發現，刺玫果作為一種天然產物活性物質，具有開發成為降糖藥物的潛力。

綜合考慮，選取70%刺玫果醇提物作為加工穩定性的研究對象。

2.2 溫度對刺玫果醇提物穩定性影響

溫度對刺玫果醇提物穩定性的影響如圖2所示，溫度對刺玫果醇提物活性物質含量影響顯著（P＜0.05）。不同加熱溫度條件下，隨著加熱溫度不斷升高，活性物質含量呈下降趨勢，穩定性逐漸減弱。刺玫果醇提物黃酮、多酚含量在50℃以下時穩定性較好，無顯著性差異（P＞0.05），這可能是因為此溫度條件下氧化酶的活性較弱，減少多酚類物質氧化后醌類物質的形成，從而抑制了刺玫果活性物質的分解速率[10]，醇提物多糖在30～70℃范圍內無顯著性差異（P＞0.05）；在相同時間內，隨著溫度的升高，90℃處理條件對刺玫果醇提物活性物質含量影響顯著（P＜0.05），刺玫果醇提物黃酮、多酚和多糖含量較30℃時分別下降了25.3%、13.67%和33.92%。隨著處理溫度的上升，刺玫果醇提物活性物質的化學結構不斷被破壞，加速活性物質分解，顯色物質花色苷在高溫下不斷被氧化，導致其穩定性有所降低[21]。綜上所述，以刺玫果深加工產品應于50℃以下條件儲藏和加工，以保護刺玫果中的活性成分。

圖2 溫度對醇提物穩定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of alcohol extracts

2.3 光對刺玫果醇提物穩定性的影響

不同光照對刺玫果醇提物的穩定性影響如圖3所示，不同光照對刺玫果醇提物含量有著顯著影響（P＜0.05）。在自然光照下條件，刺玫果醇提物黃酮、多酚含量隨著光照天數增加而逐漸下降。光照1～2 d 內，隨著光照時間的延長黃酮、多酚含量逐漸下降但變化不顯著（P＞0.05），光照5 d 后，黃酮、多酚含量較空白降低了22.52%、24.46%。隨著紫外照射時間的延長，黃酮、多酚含量也呈現不同幅度的下降趨勢，60 min 后黃酮、多酚含量較空白分別下降了37.20%、39.94%，與自然光照結果相較，紫外照射加快黃酮類化合物含量的下降速率。隨著光照天數的增加刺玫果醇提物多糖含量呈現下降的趨勢，在光照5 d 內無顯著性差異（P＞0.05），即刺玫果醇提物多糖穩定性在光因素的影響下變化較小。在紫外條件下照射40 min，刺玫果醇提物多糖含量無顯著性變化（P＜0.05），受輻射50～60 min 時，多糖含量明顯下降。

圖3 不同光照對醇提物穩定性影響Fig.3 Effect of different light on the stability of alcohol extracts

除此之外，刺玫果醇提液經過紫外輻射后，溶液顏色明顯變渾濁，可能是因為紫外輻射使黃酮類化合物內部不飽和鍵發生降解或縮合，破壞了刺玫果醇提物黃酮化合物的結構[22]。因此，紫外線對刺玫果活性物質破壞性更嚴重，為保護刺玫果生物性能及功能成分，刺玫果醇提液以及加工制品應盡量避光存放。

2.4 pH 值對刺玫果醇提物穩定性的影響

pH 值對刺玫果醇提物穩定性的影響如圖4所示，pH 值對刺玫果醇提物活性物質含量的影響顯著（P＜0.05）。在pH 值4.0～8.0 條件下黃酮含量波動較小，表現出相對穩定性，隨著pH 值升高到達10.0～12.0 的堿性條件，黃酮含量顯著降低（P＜0.05），強酸強堿環境加速黃酮化合物的降解，相對于堿性，酸性條件更有利于維持刺玫果醇提物黃酮的穩定性，這可能是由于黃酮類物質呈現出的弱酸性促進與堿性物質結合而使自身分解[23]。多酚、多糖含量在pH 值的2.0～6.0 時較穩定，無顯著性差異（P＞0.05），具有良好的穩定性，在pH 值8.0～12.0 則表現出不同程度的波動（P＜0.05），此外刺玫果醇提液在酸性條件下呈透亮的淺黃色，強堿條件下顏色最深，呈現深黃色，產生這種現象，是因為強堿作用對刺玫果醇提液花色苷的結構存在一定的影響，使羥基取代數目減少、位置改變而使顏色呈深黃色[24]。所以在生產或加工刺玫果時，應選擇弱酸性環境，最大程度維持刺玫果的生物活性。

圖4 pH 值對醇提物穩定性的影響Fig.4 Effect of pH on the stability of alcohol extracts

2.5 不同金屬離子對刺玫果醇提物穩定性的影響

如表2所示，不同濃度金屬離子使刺玫果醇提物活性物質含量均有不同程度的波動，說明部分金屬離子對刺玫果醇提物穩定性存在影響。

表2 不同金屬離子對醇提物穩定性影響?Table 2 Effect of different metal ions on the stability of alcohol extracts

Na+在1～9 mmol/L 濃度范圍內對刺玫果黃酮含量影響較小。Mg2+和K+對刺玫果醇提物黃酮有著顯著影響（P＜0.05），在濃度1～9 mmol/L范圍內，醇提物黃酮變化不穩定，無明顯規則。Cu2+對刺玫果醇提物黃酮穩定性存在顯著影響（P＜0.05），黃酮含量隨著Cu2+濃度的增大呈現先增大后下降的趨勢，在Cu2+濃度7～9 mmol/L時，有明顯的絮狀沉淀產生，與其他離子相比，Cu2+顯著降低了醇提物的黃酮含量（P＜0.05），對刺玫果黃酮有嚴重的破壞作用。出現以上現象，可能是由于黃酮類化合物上的羥基與不同金屬離子的絡合作用，使刺玫果黃酮結構改變，進而影響穩定性[24]。

Na+對刺玫果醇提物多酚影響顯著（P＜0.05），無明顯規則，在Na+5 mmol/L 時多酚含量出現峰值，而后逐漸減小。K+和Mg2+對刺玫果醇提物多酚有顯著影響（P＜0.05），但在低濃度1～3 mmol/L 時影響不顯著（P＞0.05），隨后多酚含量隨著濃度增大也有所改變。Cu2+對刺玫果醇提物多酚有顯著影響（P＜0.05），當溶液中Cu2+濃度為9 mmol/L 時，醇提物多酚含量較空白下降了17.69%。

隨著Na+濃度不斷增加，刺玫果醇提物多糖含量呈現下降趨勢，在Na+濃度1～7 mmol/L 時無顯著性差異（P＞0.05），至高濃度9 mmol/L 時多糖含量下降至最低（40.53±2.19）mg/g。K+/Mg2+對刺玫果醇提物多糖含量有顯著性影響（P＜0.05），但不同濃度之間無顯著性差異（P＞0.05），即對刺玫果醇提物多糖穩定性影響較小。Cu2+處理下，溶液顏色隨著Cu2+濃度增加不斷加深，由最初的淺黃色變為深黃色，醇提物多糖含量在9 mmol/L時達到最高，這說明Cu2+存在條件下刺玫果醇提物多糖不穩定。

3 結論與討論

抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，可有效降低葡萄糖和果糖的生成量，有助于降低餐后血糖水平[26]。本研究考察了不同體積分數乙醇提取物對降糖酶活性的影響，結果表明，刺玫果不同醇提物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有較好的抑制作用。70%刺玫果醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率較高（IC50值為1.905 mg/mL），效果僅次于阿卡波糖（IC50值為0.123 mg/mL），50%刺玫果醇提物對α-淀粉酶的抑制作用較為顯著（IC50為10.212 mg/mL）。但與α-葡萄糖苷酶相比，刺玫果醇不同提取物對α-淀粉酶的抑制作用較弱，分析原因可能是刺玫果醇提物中與α-葡萄糖苷酶活性位點結合的基團數量較多，對α-葡萄糖苷酶的活性影響較大。馬利華等[27]研究發現70%槐花醇提物對α-淀粉酶的抑制作用很弱，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著，這與本研究結果一致。刺玫果作為藥食同源的原料，具有較高的藥用價值，但其果實目前未得到充分利用，因其醇提物對降糖酶活性抑制存在濃度依賴，明確表現出具有調節餐后血糖的作用，該研究結果可為刺玫果的綜合開發利用提供參考，70%的刺玫果醇提物的綜合降糖效果最佳，可作為天然產物降糖藥物成分的主要來源。

不同加工條件和環境因素均影響刺玫果醇提物活性成分的穩定性，這在一定程度上限制了刺玫果的加工利用。因此，選擇使其穩定的因素，有助于刺玫果開發加工過程中最大程度地保留其活性成分。本實驗研究對降糖酶抑制作用較優的70%刺玫果醇提物穩定性變化可知，醇提物黃酮、多酚、多糖均對溫度較為敏感，隨著溫度的升高刺玫果醇提物穩定性逐漸降低，多糖穩定性與伍亞華等[28]對宣木瓜多糖的研究結果相似，因此適當的低溫環境能較好地維持醇提物活性物質穩定性。在自然光照條件下，刺玫果醇提物黃酮、多酚表現出相似的穩定趨勢，隨著光照時間的增加穩定性逐漸降低，相似研究結果在單性木蘭葉多酚穩定性研究中也得到證實[29]，多糖則無顯著性變化，紫外輻射加速降解刺玫果醇提物黃酮、多酚、多糖的生物活性，破壞最為顯著，因此，刺玫果的儲藏加工盡量避免陽光直射。本研究中，刺玫果醇提物活性成分受pH 值的影響產生不同的變化，弱酸及中性條件有利于保持黃酮穩定，強酸強堿條件對黃酮結構破壞程度較大，不利于黃酮結構的穩定，趙丁一[30]在研究中也發現山核桃醇提液黃酮質量濃度在弱酸及中性條件下具有良好的穩定性；多酚、多糖在偏酸性條件下趨于穩定。不同金屬離子條件下，刺玫果醇提物黃酮、多酚、多糖穩定性表現出多樣性和復雜性：刺玫果醇提物黃酮對Na+穩定，K+、Mg2+均不穩定，與其他離子相比，Cu2+的破壞性更為明顯；醇提物多酚對低濃度的K+、Mg2+穩定，多糖對低濃度的Na+無顯著影響，Cu2+則影響顯著，出現以上現象可能是由于不同金屬離子與多酚、黃酮、多糖類化合物發生螯合作用，改變了物質的分子結構，產生的其他復雜的化合物影響活性物質顯色，致使活性物質穩定性改變[31]。因此，刺玫果醇提物相關產品中，盡量避免添加與Cu2+相關的物質，可在安全范圍內添加適量低濃度的K+和Mg2+。

本實驗僅研究了刺玫果醇提物對降糖酶活性以及加工穩定性的影響，通過適當條件的加工，可保障活性，為生產刺玫果高附加值的功能性產品提供參考，但對體外的降血糖效果還有待于進一步研究。杜佳林等[32]研究認為刺玫果不同提取物可以明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠糖化血紅蛋白和果糖胺的含量。本實驗后續將對刺玫果70%醇提物進行系統研究，通過建立細胞胰島素抵抗模型，驗證其改善IR-HepG2 細胞糖代謝效應，以表征刺玫果醇提物降糖活性，為進一步開展體內活性驗證試驗提供參考，從而充分挖掘刺玫果的潛在利用價值。