青藏高原東部22株栽培與野生羊肚菌的分子進化分析

杜軍華 姜東伯 張津京 余建平 宋長新 劉甜 陳輝 陳群 吳曉明

摘要：為了更好地區分不同羊肚菌菌株，確定其生物多樣性，對10個栽培羊肚菌和12個野生羊肚菌進行分析。通過對5個基因區域進行DNA測序，借助數據庫檢索、多序列比對和分子進化等方法進行分析，發現10種栽培樣本屬于3種已知物種：六妹羊肚菌（ Morchella sextelata ）、梯棱羊肚菌（ M. importuna ）、七妹羊肚菌（ M. septimelata ）。同GenBank核苷酸序列數據庫中已測序樣本相比，這些樣本都含有一定程度的序列差異，體現在栽培的樣本也具有遺傳多樣性。12個野生型樣本同六妹羊肚菌、小海綿羊肚菌（ M. spongiola ）、 Morchella prava 物種更接近，并顯示出較大的序列差異，其中1株同所有已知羊肚菌品種均有較大的遺傳差異?？紤]到這些野生羊肚菌的生長地域同其他羊肚菌生長地域的差異，推斷由于獨特的地理環境，使野生羊肚菌演化出了特有的基因序列。本研究獲得了青海一些地區羊肚菌的分類、分子演化和多樣性特征，有助于鑒定、選育適合栽培的羊肚菌菌株。

關鍵詞：子囊菌類;羊肚菌;分子進化;多序列比對;青藏高原;遺傳多樣性

中圖分類號： S646.702? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0028-07

收稿日期：2021-06-15

基金項目：青海省應用基礎研究（編號：2018-ZG-790）。

作者簡介：杜軍華（1965—），男，河北故城人，副教授，主要從事生物技術及應用研究。E-mail：djh319@126.com。

通信作者：杜軍華，副教授，主要從事生物技術及應用研究，E-mail：djh319@126.com;吳曉明，博士，副教授，主要從事生物信息研究，E-mail：wxm@mail.xjtu.edu.cn。

羊肚菌是公認的最重要的野生食用、藥用真菌之一，分布于世界各地，特別是在北溫帶地區[1-2]。其口感脆嫩，風味獨特，富含維生素、人體必需氨基酸和特殊的多糖成分，具有極高的營養價值和藥用價值[3-5]。目前我國已報道的羊肚菌種類較多，其中常見的有圓錐羊肚菌（ Morchella conica）、小頂羊肚菌（M. angusticeps）、羊肚菌（M. esculenta）、褐色羊肚菌（M. umbrina ） 等[6]。近年來，人們對其營養價值、生物學特性和物種多樣性研究取得了重大進展，一些羊肚菌品種也已被廣泛栽培，顯示出良好的經濟效益[7]。

目前，僅有13種羊肚菌品系完成全基因組測序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/organism/5193/），而已知羊肚菌屬（NCBI數據庫taxid編號：5193）包含多達30個物種，每個物種都有不同的菌株。目前Index Fungorum數據庫（http：//www.indexfungorum.org/Names/Names.asp） 也收錄了多達353種羊肚菌（截至2021年12月）。許多菌株在形態上相似，難以區分，利用基因序列準確鑒定羊肚菌的種類和菌株尤為重要。

羊肚菌屬的分類研究已有多年，其子囊體的外觀常隨環境、氣候等外界條件的變化而變化，在形狀和大小上具有高度的多態性。雖然子實體的微觀結構相對保守，但從屬類群的定義非常困難，菌株之間的定義也不明確，影響了該類群資源的合理利用和開發[8-9]。對于分類學家和野外真菌學家來說，羊肚菌屬于一個非常復雜的屬。由于形態差異不明顯，同一種類的羊肚菌由于生存環境和營養條件的差異往往表現出形態多樣性，根據外觀和形態對羊肚菌進行分類往往存在一定偏差。

基于多基因位點進行分析已經成為推斷羊肚菌物種的新方法。使用ITS-RPB1-RPB2-EF1-α組合數據集進行基因分析，人們已經將羊肚菌分為黑羊肚菌分支（ Elata clade ）、黃羊肚菌分支（ Esculenta clade ）、變紅羊肚菌分支（ Rufobrunnea clade ）[10-11]。拉丁二項命名法也已用于羊肚菌命名，即用 Mes（E. clade）或Mel（E. clade） 跟上一個阿拉伯數字表示，自2012年以來也被廣泛使用。迄今為止，已經利用系統發生分析的方法，確定了68個羊肚菌品種的關系，包括38個屬于黑羊肚菌、28個屬于黃羊肚菌、2個變紅羊肚菌[3，12-13]?；谶@些已知物種的命名，有助于準確地進行其他羊肚菌品種的鑒定。

在青海地區高緯度和寒冷的氣候條件下，動植物已經進化出了獨特的生長模式。該地區的土壤特性和生態系統，也成為野生羊肚菌的良好生長環境。作為一種重要的經濟作物，適合栽培的羊肚菌新品種也需要不斷被篩選出來，以促進農業經濟的發展。為了更好地了解青海地區羊肚菌的菌株類型、分布特點、分子標記和進化特征，筆者對22個樣本進行分類相關基因的測序，通過序列比較的方法，以確定菌株特點及其遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

本研究于2020年5月，在大巴山東部地區北山農場共收集了107個樣本。經過基于形態的初步篩選，選取其中有代表性的12個野生菌株，繼續對其進行分子水平的分析和鑒定。同時，筆者也從青海省西寧市周圍的羊肚菌栽培基地，選取了10個栽培品種，進行菌株的亞種鑒定。樣本信息見表1、表2。

1.2 DNA測序區域的選擇

為對10個栽培品種和12個野生品種進行進化分析和分子鑒定，本研究對5個突變率較高的基因區域設計引物并進行了測序。這些區域是rDNA內部轉錄間隔區its1～its4 （ITS）、編碼RNA聚合酶Ⅱ的最大亞基（RPB1）、編碼RNA聚合酶Ⅱ的第二大亞基（RPB2）、翻譯延伸因子 （EF1-α）、核糖體大亞基（LSU）。對每個樣品進行DNA提取分離后，將凝膠中的DNA樣品切割純化，回收目的片段，用相應的引物和合適的條件進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增（表3、表4），擴增程序根據引物退火與片段大小做適當調整，擴增后的分子進行測序，最終共獲得122條序列。

1.3 生物信息學分析

為了獲取樣本測序序列在NCBI數據庫中的相似序列，本研究利用基于局部比對算法的搜索工具（BLAST）進行同源序列檢索，利用MUSCLE多序列比對程序確定各條序列的位點對應關系，利用MEGA等軟件分析樣品序列的親緣關系。

1.3.1 數據庫同源序列獲取

為了檢測已測序片段與已知序列的相似性，并確定其同源序列，使用序列相似性搜索程序BLASTN[14]，設置查詢參數，從GenBank數據庫中提取同源序列。對搜索結果中同一樣本的不同片段進行合并以剔除重復結果，只保留物種屬于羊肚菌屬的序列進行進化分析。對于 ITS 基因，從SD樣本和DM樣本共檢索到422個不同物種的序列。另外3個基因RPB1、RPB2、EF1-α檢索到的同源序列分別為142、156、127條。

1.3.2 基于索引號的羊肚菌測序序列獲取

一些研究人員從事羊肚菌相關研究，其樣本的測序序列也已被上傳到GenBank數據庫[4，15-18]，總共獲得162個序列ID。筆者使用shell腳本編程，并借助查詢工具E-utilities （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/home/tools/）下載相關的序列，過濾后，共得到110個樣本，包含所有4個基因序列。

1.3.3 多序列比對

使用MUSCLE[19]來進行多序列比對;使用BioEdit 7.2.6進行序列編輯操作;使用Gblock（http：//phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/）進行位點選擇[3]。

1.3.4 序列替代模型選擇

用IQ-tree中的ModelFinder[20]來找到最佳核苷酸替換模型。該模型基于Bayesian信息準則（BIC）進行模型參數的篩選。ITS-rpb1-rpb2-ef1α的最佳DNA替換模型為K2P+G4，表示堿基的轉換、顛換有不同的頻率。進化樹的構建和可視化采用MEGA軟件[21]。

1.3.5 系統發生樹的構建

采用基于Tamura-Nei模型[22]的最大似然方法進行分子系統發育分析。算法根據一個初始樹進行啟發式搜索，保留似然性較好的系統發生樹作為最終結果。根據每個位置的替換次數得到樹中的分支長度，并用1 000次bootstrap重復估計系統發生樹中每個節點的一致性。

2 結果與分析

2.1 基于RPB1基因的羊肚菌親緣關系

對22個樣品進行PCR擴增和DNA測序，成功獲得ITS、RPB1、RPB2、EF1-α、LSU序列。對低質量測序結果過濾后，共得到122個片段，總長度為76 kb。

RPB1基因在每個樣品中都被成功測序，用它查詢NCBI數據庫，得到多個羊肚菌屬的同源序列。經過篩選，并對于每個羊肚菌品系保留1～2條序列，然后用MUSCLE程序構建多序列比對。利用MEGA和最大似然法進行進化分析，最終得到了1棵包含22個樣本和111個已知物種或菌株同源序列的羊肚菌系統發生樹。初步確定了樣品與已知羊肚菌品種之間的進化關系，并使用FigTree 1.4.4 （http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）來顯示進化樹，體現品種之間的類別關系（圖1）。

如圖1所示，在區域1中可以發現樣本DMBJD039、DMBXY044和DMBXY049具有非常高的同源性關系，與sp._Mel-29和sp._Mel-28非常接近。從形態上，這3個品種區分為尖頂羊肚菌和小羊肚菌。

在區域2中，含有DMBBY003、DMBHH076、DMBHM034的分支被鑒定為六妹羊肚菌。栽培株SDQYXZ001（圖2）、SDQYNS006、SDQYMK009、SDQYDB005和SDQYBS010也存在于該分支。這些栽培株來自西藏林芝、湖北恩施、青海班瑪、甘肅迭部、青?；ブ鹊?，表明此品種羊肚菌具有較高的適應性。

在區域3中，栽培菌株SDQYSC004和SDQYTL008分別來自四川金堂和青海西寧。它在進化上與同七妹羊肚菌相似，具有較高的同源性。

在區域4中，3個栽培株SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002和2個野生菌株DMBHH052、DMBHM088與梯棱羊肚菌具有較高的同源性。SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002分別來自青海西寧、甘肅天水、甘肅卓尼。這表明梯棱羊肚菌也適宜在2 000 m的高海拔地區栽培。

區域5中，DMBBY014、DMBMM064、DMBCB101和DMBMM005與sp._Mes-5和sp._Mes-6最接近，但分支較長，表現出種間的差異。從形態上，4個品種有所區別，被認為是半圓羊肚菌、羊肚菌、粗柄羊肚菌等，因此，有必要進一步確定其種類信息。

由于RPB1基因在多數樣本中具有較高同源性，一些樣本不能很好地區分，需借助更多基因序列進行鑒定。

2.2 基于多基因序列組合的樣本親緣關系分析

本研究對SD樣本（表1）和DM樣本（表2）均進行多基因測序，以此進行多基因綜合分析。對所有樣本先進行多序列比對（multiple sequence alignment，簡稱MSA），再將單個基因MSA結果合并成多基因MSA結果，以確定樣本之間的關系。

10個SD樣本擴增出RPB1和 EF1-α 基因，并獲得了測序結果。因此，筆者構建了包含這2個基因的MSA，并選擇Tamura-Nei模型作為DNA替代模型構建進化樹，結果如圖3所示。

單基因分析提供的分辨率不高，很難區分物種之間的詳細差異，而通過雙基因進化分析，可以清楚地看到樣本之間存在差異。在圖3中，這棵樹可以分為3個分支，分別屬于3個不同的物種。各分枝間樣品間也存在一定的進化距離，說明在青海成功培植的羊肚菌種也有種間差異。

對于野生型DM樣本，所有樣本中成功測序的基因有3個，分別是RPB1、RPB2、LSU。利用這些基因的MSA構建進化樹，如圖4所示。

12個DM樣品在形態上有很大差異，說明它們屬于不同的物種。從進化樹中可以看到4個分支，每個分支與其他分支之間的距離都很大，所以筆者認為其中有超過4個不同的物種。特別是，樣本DMBMM064有一個更長的分支，這意味著該樣本與其他樣本差異更大。

2.3 基于多基因數據庫搜索的樣本品系推測

通過在數據庫中搜索單個基因序列來識別物種，將會由于序列相似性而檢索出多個不同結果，這給確定樣本的種類帶來了巨大困難。因此，本研究結合了各樣本中多個基因的序列相似性搜索結果以及形態學特征進行了樣本推斷。使用BLAST來進行同源序列搜索，在查詢參數中，設置物種限定為羊肚菌屬（ Morchella ），然后提取每個查詢結果的物種信息，并根據每個樣本的多基因搜索結果確定羊肚菌品種，獲得最接近的物種（表5、表6）。

2.4 同已文獻報道羊肚菌品系的關系

為了研究青海羊肚菌與其它報道品種之間的關系，從文獻檢索到序列的索引號，并從GenBank提取了162個樣本的基因序列。在本研究的樣本中，有20個包含同文獻匹配的4個基因序列區域。經過序列比對和分子進化分析，得到進化樹（圖5）。

可以看出，本研究的樣品與報道的羊肚菌的遺傳距離較大。這也說明青?；ブh北山野生羊肚菌具有相對獨立的進化系統，且存在種群隔離的趨勢。DM樣品是野外采集的野生樣品，可以看出DM樣品之間的差異大于SD樣品。

2.5 典型的序列差異

為了識別樣本序列和現有已知羊肚菌品種的序列差異，筆者進行了序列比較。對于RPB1基因，合并了133個羊肚菌同源序列，它們是SD樣本、DM樣本和從數據庫檢索得到的同源序列。MSA比較結果發現，DMBMM064與其他序列有相對較大的遺傳差異。將此序列與最接近的樣本序列JQ322139.1進行了比較，獲得點陣圖分析結果如圖6所示，紅圈中的線是不連續的，這意味2個樣本中的RPB1基因序列不同，表明2個樣本有很大的進化距離。

如圖7所示，該樣本序列同數據庫序列的比對結果，是匹配度最高的結果，尚且存在一些差異，顯示出本樣本獨特，其功能和特征還需進一步的探索。

3.6 形態和地理分布

本研究發現，青海野生羊肚菌有較高的序列多樣性，與其他已知的羊肚菌品種相比，包含DMBBY014、DMBMM064和DMBMM005的分支，有更高的序列差異和較長的進化距離，可能包含新的品系和菌株，較高的品系多樣性，為羊肚菌的栽培和推廣提供較好的遺傳資源。

3 討論與結論

在本研究收集了22個羊肚菌樣本，并為每個樣本進行了5個基因區域的測序。根據樣本的測序結果，結合從GenBank數據庫下載的同源序列，并進行進化分析，探索它們之間的差異。結果表明，栽培樣本包括3個主要品種，分別是六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌，這些品種均屬于黑色羊肚菌支系，是我國食用菌栽培行業發展迅速的一類真菌，具有重要的經濟和科研價值[23]。栽培樣本的DNA序列同數據庫已有條目相比，存在一定程度的序列變異，表明具有一定序列變異的品種，已能夠很好地適應當地種植環境，某些位點的變化不會影響羊肚菌生長的適應性。

對于野生羊肚菌樣本，它們同已知的物種有更高的序列位點差異，在野生品種之間也有較大的遺傳距離，這表明它可能含有新的羊肚菌菌株或新的羊肚菌品種。與此同時，這些野生樣本收集自較小范圍的特定地理區域，該區域同其他羊肚菌的生長區域相隔很遠，這也體現出特定的環境有助于進化出這些新的羊肚菌菌株。

序列比較也發現了樣本序列和數據庫條目之間的一些差異。例如，DMBMM064與所有已知物種的遺傳距離相對較大，這表明它經歷了較長的分化時期，可能是新的羊肚菌品種。多方面的全面分析將非常有必要。全基因組測序和基因功能研究將有助于發現新品種及其功能特征，這對培養野生的新菌株也非常重要。

本研究初步鑒定了22個適合在中國北方生長的羊肚菌樣本，擴大了筆者對羊肚菌屬的多樣性和分布特點的了解，這對于選育和栽培羊肚菌新品種，獲得經濟效益，更深入、全面的分子水平分析將非常有幫助。

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