生物工程角膜應用于感染性角膜炎的臨床觀察

康黔，楊雨昆，姚曉明

(成都愛迪眼科醫院角膜病?？?，成都 610072)

感染性角膜炎是一大類致盲率極高的角膜病變。針對該類疾病較多采用角膜移植進行救治。及時的角膜移植可以有效控制感染，甚至部分恢復患者視力。角膜供體嚴重缺乏是限制急診角膜移植手術開展的主要原因。尋求一種在一定程度上能替代人供體角膜的材料，讓嚴重的角膜炎患者能及時接受角膜移植治療，挽救眼球及視力，是角膜移植醫師所非常期望的。生物工程角膜(脫細胞豬角膜基質)于2005年開始臨床試用，后經全國多中心研究，在155名患者知情同意的情況下，經過5年完成生物工程角膜移植的臨床試驗，研究證實其有效率達到94.4%，并于2015年獲得了我國食品藥品管理局的上市批準[1]。

四川省位于我國西南部，氣候潮濕，又是西部農業大省，每年農忙季節均有大量的感染性角膜炎患者發病。很多患者因供體材料缺乏而無法及時行治療性角膜移植，導致視力嚴重受損甚至眼球不保。為了對感染性角膜病患者進行急診角膜移植手術治療，緩解供體材料的匱乏。成都愛迪眼科醫院自2018年9月至2021年2月使用生物工程角膜(脫細胞豬角膜基質，艾欣瞳)為19例感染性角膜病患者實施板層移植手術并取得較好療效。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究經成都愛迪眼科醫院醫學倫理委員會批準，按照赫爾辛基宣言執行，患者均簽署知情同意書，確認所有操作和信息。術前詢問患者病史，行裂隙燈顯微鏡、激光掃描共焦顯微鏡、前節光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)掃描以及角膜刮片檢查。納入標準：藥物保守治療1～2周以上，病灶繼續擴大或者病情無法控制者，相關檢查提示角膜病灶深度大于角膜厚度1/2以上，未累計全層者。排除標準：病灶累計角膜全層或穿孔、視網膜脫離。實驗組使用豬角膜脫細胞基質生物工程角膜(艾欣瞳，艾尼爾角膜工程有限公司，深圳)。同期因感染性角膜炎而使用捐獻角膜行板層角膜移植的案例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 手術方法

所有手術由同一名術者完成(康黔)。采用表面麻醉及2%利多卡因球后阻滯麻醉。根據角膜病變范圍確定植床大小，選用合適環鉆(多為7.25～7.5 mm)劃界，標示出病變角膜切除范圍。取出4 ℃保存的凍干艾欣瞳，厚度為400 μm，4 ℃復方生理鹽水復水15 s左右，采用與植床等大的環鉆鉆取艾欣瞳植片備用。手法濕剝切除包括角膜病變區及病變邊緣外約0.25 mm范圍的正常角膜組織，制作植床。剖切植床過程中，用林格液滴淋植床，通過剖切界面上的水層，易于觀察感染灶是否被徹底剖除干凈。將艾欣瞳植片置于植床，10-0尼龍線間斷縫合植片?？p合深度達植片厚度的4/5以上。線頭埋藏至植床層間[2]。結膜下注射5%頭孢唑林鈉0.4 mL。單眼包扎，眼罩保護。對照組術式相同，僅角膜來源差異。

1.2.2 術后治療

術后3 d內針對原發病病原體分別給予靜脈滴注頭孢唑林鈉或伏立康唑、局部滴用左氧氟沙星眼液(可樂必妥)、普羅納克眼液、他克莫司眼液和表皮生長因子眼液等。根據感染控制情況靜脈給藥5～7 d，術后2～4周開始眼部滴用皮質類固醇眼液、他克莫司眼液及人工淚液，并逐漸減量維持6～12個月。依植片愈復情況、角膜全景圖及醫學驗光結果，術后2個月開始分次拆除縫線。

術后第1年每個月復診1次，行眼前節照相、前節OCT、眼壓、視力檢查及驗光檢查。

1.2.3 排斥反應評分標準

1)上皮愈合不良(面積大小)：無為0分，＜1/3植片范圍為1分，1/3～1/2植片范圍為2分，＞1/2植片范圍為3分。2)早期植片水腫(裂隙燈下觀察)：不明顯為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分。3)植片溶解(面積大小)：無為0分，＜1/3植片范圍為1分，1/3～1/2植片范圍為2分，＞1/2植片范圍為3分。4)角膜緣新生血管(象限分布)：無為0分，＜1個象限為1分，1～2個象限為2分，＞2個象限為3分。5)遠期植片透明度(裂隙燈下通過角膜植片觀察虹膜)：虹膜紋理清晰為0分，虹膜紋理模糊窺見為1分，虹膜紋理完全窺不清僅見虹膜顏色為2分，完全窺不見虹膜顏色為3分。

1.3 統計學處理

采用SPSS 10.0統計學軟件進行數據分析，行Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前資料

在19例患者中，女9例(47.37%)，男10例(52.63%)。70歲以上1例，＞60～70歲5例，＞50～60歲5例，＞40～50歲6例，＞30～40歲1例，20～30歲1例，平均年齡53.32歲。術前診斷：細菌性角膜炎7例(36.84%)，真菌性角膜炎8例(42.11%)，病毒性角膜炎4例(21.05%)。術前視力檢查：光感3例(光定位準確)，手動5例(光定位準確)，數指4例，3.0～3.9者7例。外眼及眼附屬器正常。

2.2 術后角膜炎癥控制情況及角膜愈合程度

術后2～3 d，患眼眼表炎癥明顯減輕，睫狀充血逐步消退，術前伴有的角膜內皮斑或者無菌性積膿均消失。術后第2天，角膜上皮開始進入生物工程角膜植片緣，大部分患者在術后4～7 d時上皮修復。1周后，角膜熒光染色可見角膜上皮完全覆蓋角膜植片。隨訪1～14個月，所有病例術后圍手術期均未發生原發感染復發。植片成活18例(94.74%)，1個月內植片溶解再手術1例(5.26%)。

2.3 視力變化(以患者最近1次復查視力為術后視力)

裸眼視力4.0～4.5者15例(78.95%)，3.0～4.0者3例(15.79%)，數指1例(并發白內障，5.26%；表1)。

表1 術前術后裸眼視力對比Table 1 Comparison of uncorrected visual acuity before and aft er operation

2.4 術后植片透明度及有無排斥反應發生

生物工程角膜排異反應早期表現有急性睫狀充血、植片水腫、上皮愈合不良及植片溶解等。中長期表現為角膜緣新生血管侵入，植片透明度緩慢減退，視力逐漸下降等，與人來源角膜排斥表現類似。本試驗組病例在上皮修復后植片透明度逐漸提高，3～6個月時植片透明度最好，6個月后，部分患者可見慢性排異反應，新生血管侵入角膜緣進入角膜層間或者圍繞植片緣生長，植片緣呈半透明狀改變。局部強化他克莫司、百力特眼液可使新生血管萎縮消退、植片透明度改善。排斥預后與對照組間差異無統計學意義(P=0.736，表2)。但中長期觀察(6～12個月及以上)發現生物工程角膜緣新生血管更明顯、植片透明度降低比例較人供體角膜高。遠期生物工程角膜植片緣可發生環形玉白色半透明狀渾濁，但中央區透明度良好，對視力影響不大。

表2 生物工程角膜與人供體角膜術后排異反應評分Table 2 Rejection score of bioengineered and human donor corneal transplantation

續表2

2.5 典型病例

圖1～4所示為4例行生物工程角膜板層角膜移植術的典型病例。

圖1 病例1：患者女，49歲，左眼病毒性角膜炎，行生物工程角膜板層角膜移植術Figure 1 Case 1:A 49-year-old female patient with viral keratitis in her left eye underwent bioengineered lamellar keratoplasty

圖2 病例2：患者男，50歲，右眼真菌性角膜炎，行生物工程角膜行板層角膜移植Figure 2 Case 2:A 50-year-old male patient with fungal keratitis of the right eye underwent bioengineered and lamina corneal transplantation

圖3 病例3：患者男，67歲，左眼紅痛視力下降2 d，銅綠假單胞菌潰瘍，行生物工程角膜行板層角膜移植術，術后全身靜脈滴注阿米卡星治療3 d，局部妥布霉素眼液1次/h，他克莫司眼液點眼4次/d，溴芬酸鈉眼液點眼2次/d，玻璃酸鈉眼液點眼4次/dFigure 3 Case 3:The patient is a 67-year-old male,with the left eye eyesight decline in 2 d,pseudomonas aeruginosa ulcer,biological engineering corneal andante layer corneal transplantation,postoperative systemic intravenous drip 3 days amikacin therapy,local tobramycin eye drops 1 time per hour,tacrolimus eyedrops eye 4 times per day,bromfenac sodium eye drops eye for 2 times per day,the sodium hyaluronate drops eye 4 times per day

圖4 病例4：患者女，39歲，行右眼病毒性角膜炎行生物工程角膜板層角膜移植術Figure 4 Case 4:A 39-year-old female patient with right eye viral keratitis underwent bioengineered lamellar keratoplasty

3 討論

我國是世界上盲人最多的國家之一(雙眼人盲達600萬～700萬)，其中因角膜病致盲的患者為200萬～300萬，而且每年以10%的比率增加[2-4]。治療角膜盲的第一位方案就是角膜移植，而感染性角膜炎是我國目前角膜移植手術的主要適應證[5]。角膜來源匱乏使得我國無法為感染性角膜病提供急診手術所需[2-5]。

2010年武漢協和醫院眼科首次將由豬角膜制成的人工生物角膜“艾欣瞳”應用于人類角膜移植。2015年“艾欣瞳”通過國家食品藥品監督管理總局注冊并應用于臨床，成為全球首個生物工程角膜產品。有研究團隊[6-10]使用人工生物角膜移植治療真菌性角膜炎患者，通過最少6個月的隨訪證實了人工生物角膜應用在人角膜移植中的安全性和有效性。

本組病例中植片成活率達到94.74%，大部分患者保全眼球的同時恢復了有用視力。艾欣瞳植片成活的關鍵在于早期上皮化。術后3 d，在植片邊緣線結處，角膜上皮生長；術后10 d，角膜水腫基本消退，角膜上皮細胞跨過植片邊緣，向中心生長，逐步完成角膜上皮化，但是熒光素染色仍能觀察到點狀染色；術后1個月，植片透明度逐漸恢復，角膜上皮化良好。豬脫細胞角膜基質能夠與角膜上皮細胞形成緊密結合，上皮細胞黏附穩定[11-13]。本研究顯示：術后2～3 d，角膜上皮開始進入生物工程角膜植片緣，大部分在4～7 d上皮修復并逐漸排列規則。

對照組植片上皮術后1～3 d能修復，且上皮完整修復后可出現良好透明度。而生物工程角膜組透明度隨上皮修復逐漸改善，術后1～2周時逐漸透明，1個月左右趨于穩定，且上皮修復越快，后期植片透明度更佳。研究[12,14-15]報道：約術后5個月，在共焦顯微鏡下可觀察到植片上皮下有少量神經纖維長入，提示上皮愈合后要持續注意上皮情況。此外，遠期觀察(6～12個月及以上)部分生物工程角膜植片緣有新生血管侵入，基質呈環形玉白色半透明狀渾濁，透明度較同期移植的人供體板層角膜植片低(病例1～3)。

本組1例病毒性角膜炎患者(病例4)于術后1個月出現植片溶解，可能與復水過度、縫線松緊不一、植片-植床尺寸設計不當等多重因素有關，進而導致術后2周縫線松脫，植片上皮化延遲，甚至基質溶解。重新縫合后，雖然植片透明度一度得到改善，但因溶解的植片結構難以修復。更換人角膜板層移植3個月后，矯正視力達4.8。

本研究結果顯示：與脫水保存的人角膜植片相比，艾欣瞳植片復水需時大大縮短，復水后植片迅速膨大，可能與其異種生物屬性有關。植片復水開始后用食指和拇指捏持植片，感知植片由“硬”變“韌”且稍可彎曲即停止復水，同時及時將植片的水分吸凈，整個復水時間不應超過15 s。植片直徑應與植床相同，否則植片極易超過植緣形成“植片騎跨”而導致植片-植床無法良好對合，影響縫合及上皮愈復。此外，與同種異體角膜植片相比，艾欣瞳植片的縫線易于松動，會導致上皮難以愈合，基質溶解。因此術后需嚴密觀察，一旦縫線松動即行拆除，必要時可重新縫合，但縫針應避開原有線道以防止針孔擴大、豁開植片。我們自術后2個月起即逐步拆線，比同種異體角膜移植拆線早1～2個月，這將有助于減少因松線引起的炎性反應和植片溶解[14,16-17]。

綜上，生物工程角膜在上皮修復時間、植片透明度、植片遠期穩定性等方面不及新鮮同種異體角膜植片，但生物工程角膜基質具有較好的結構替代功能，移植后能夠在人眼長期存活，部分治療性角膜移植患者的視力得到一定程度的改善。在緊急情況下，生物工程角膜可作為同種異體角膜的替代材料，對患者進行急診角膜移植。盡管該材料的適用范圍較窄，僅用于藥物治療無效的尚未穿孔的角膜潰瘍，但仍有望在一定程度上緩解角膜供體的缺乏。有學者[18-20]觀察到移植的豬脫細胞基質內并未出現基質細胞，推測豬角膜基質本身并不適合人角膜基質細胞的生長，不能排除豬角膜脫細胞基質存在某些缺陷。由于目前同類研究觀察的樣本量較少，觀察時間較短，其圍手術期并發癥的處理以及遠期預后及安全性評價還需更大樣本量的長期觀察和研究。

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