海王鹿皮膠免疫調節作用研究*

李會影 康櫻櫻 王慶 翟英濯 程憲春

吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130021

動物藥作為中藥的三大來源之一，在我國具有悠久的應用歷史，豐富的臨床經驗。目前，常用有六種補膠藥材，如阿膠、黃明膠、龜甲膠、鱉甲膠、鹿角膠、魚鱗膠等，均存在廣闊的發展潛力。海王鹿皮膠是由吉林海王健康生物科技有限公司研制的，以養殖鹿鹿皮為原料，經熬膠取汁、濃縮凝膠等工藝制成的符合食品安全國家標準的普通食品[1，2]。探討海王鹿皮膠的免疫調節功能是針對鹿皮膠的全新研究，通過建立免疫低下動物模型，觀察海王鹿皮膠與阿膠對免疫低下小鼠的免疫調節作用差異，為將海王鹿皮膠開發成為保健食品提供藥理學依據。

1 材料

1.1 鹿皮膠 鹿皮膠，吉林海王健康生物科技有限公司生產，批號:20180621。以養殖鹿鹿皮為原料，棕色至棕紅色的長方形塊狀固體，味微甜，略腥。配置方法:用少量黃酒中蒸化配置合適濃度的水溶液。

1.2 阿膠 阿膠，山東東阿阿膠股份有限公司提供，批號:20180910。

1.3 實驗動物 SPF級小鼠，昆明種，性別:雄性，體重18～22g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號:SCXK(遼)2020－0001。飼養于清潔級動物室，室溫:22－25℃，相對濕度:40%－50%。采用標準飼料喂養，自由飲水，墊料為玉米芯，放射線同位素鈷60輻照消毒。雌、雄分籠飼養，每籠10只。實驗前動物適應性喂養3天。

2 試驗方法

2.1 鹿皮膠對免疫低下小鼠單核－巨噬細胞系統碳粒廓清功能的影響 取健康昆明種小鼠60只，體重18～22g，雄性，采用隨機數字法，將其分為5組，正常對照組、阿膠對照組、鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組，每組10只，各組均連續給樣品30天。從給藥第27天開始，正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環磷酰胺，連續3天。于末次灌胃后1小時，各鼠由尾靜脈按劑量(0.1ml/10g體重)注射印度墨汁，然后在注射2min及12min時，從小鼠眼靜脈叢取血20ul，加入濃度為0.1%碳酸鈉溶液2ml中，搖勻，靜置1h，然后以碳酸鈉溶液作空白對照，采用分光光度計測光密度OD值[3]。最后，頸椎脫臼處死動物，剖取肝臟、脾臟稱重，計算廓清指數K值、吞噬指數α值。結果見表1。

2.2 鹿皮膠對免疫低下小鼠免疫器官重量的影響 取60只健康昆明種小鼠，性別為雄性。體重為18～22g，分組給藥方式如2－1。阿膠對照組和鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組按以上所示劑量。從給藥第27天開始，正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環磷酰胺，連續3天。建立免疫機能低下小鼠模型，正常對照組注射等量生理鹽水。各組小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12h，稱重，脫頸椎處死，仔細剝離脾臟、胸腺后稱重，并計算脾指數及胸腺指數[4]。

2.3 鹿皮膠對免疫低下小鼠血清溶血素的影響 取60只健康昆明種小鼠，性別為雄性。體重為18～22g，分組給藥方式如2－1。阿膠對照組和鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組按以上所示劑量。從給藥第27天開始，正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環磷酰胺，連續3天。建立免疫機能低下小鼠模型，正常對照組注射等量生理鹽水。①SRBC:于綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中搖動脫纖維，4℃冰箱保存。②制備補體:采集多只豚鼠血分離血清，將1ml壓積的SRBC加入到5ml豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經常震蕩，離心取上清，用時以SA液按1:8稀釋。③免疫動物 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，2000r/min每次離心10min。將SRBC配成2%(v/v)的生理鹽水細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml進行免疫，5d后，摘眼球取血至離心管中，放置1h，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。④溶血反應:將血清∶SA緩沖液＝1∶200(V/V)稀釋后，冰浴中各試管依次加入0.5m L 稀釋血清、0.25m L 10%SRBC、0.5ml補體(用SA液按1∶8稀釋)，另設不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置37℃ 恒溫水浴中保溫10～15min，冰浴終止反應。2000r/min離心10min，取上清液0.5m L，加都氏液1.5m L。同時取10%SRBC 0.125m L，加 都 氏液1.875m L，充分混勻，室溫放置10min，于570nm 處以對照管做空白，分別測血清溶血素含量，計算半數溶血值(HC50)[5]。

3 試驗結果

3.1 海王鹿皮膠對小鼠單核－巨噬細胞功能的影響表1結果表明:與正常對照組比較，模型對照組小鼠的廓清指數明顯降低，P＜0.001，差異極顯著的統計學意義；吞噬指數略降低，P＜0.05，差異具有統計學意義，說明免疫低下小鼠模型復制成功。與模型對照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的廓清指數K值明顯升高，P＜0.05，差異具有統計學意義；阿膠對照組的廓清指數K值無明顯變化，P＞0.05，差異無統計學意義。

表1 海王鹿皮膠對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響(±s)

表1 海王鹿皮膠對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響(±s)

注:與空白對照組比較，＃P＜0.05，＃＃＃P＜0.001，與模型對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001，差異具有統計學意義。

組別 動物數(只) 劑量(g/kg) 廓清指數K值 吞噬指數α值正常對照組 10 －－ 0.060±0.016 6.617±0.474模型對照組 10 0.016±0.010＃＃＃ 5.240±1.556＃阿膠對照組 10 0.39 0.024±0.015 5.595±0.994海王鹿皮膠組 10 1.04 0.027±0.007* 6.042±0.673海王鹿皮膠組 10 0.52 0.021±0.004 5.587±0.454海王鹿皮膠組 10 0.26 0.023±0.011 5.963±1.183

3.2 海王鹿皮膠對小鼠脾指數、胸腺指數的影響 表2結果表明:與正常對照組比較，模型對照組小鼠的脾指數和胸腺指數明顯降低，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義，說明免疫低下小鼠模型復制成功。與模型對照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義；阿膠對照組的胸腺指數明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義。且阿膠對照組和海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數比較，P＞0.05，差異無統計學意義。

表2 海王鹿皮膠對小鼠脾指數、胸腺指數的影響(n=10，±s)

表2 海王鹿皮膠對小鼠脾指數、胸腺指數的影響(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，＃＃＃P＜0.001，與模型對照組比較，***P＜0.001，差異具有統計學意義。

組別 動物數(只) 劑量(g/kg) 脾指數(mg/g) 胸腺指數(mg/g)正常對照組 10 — 3.346±0.316 1.127±0.364模型對照組 10 — 1.951±0.302＃＃＃ 0.330±0.256＃＃＃阿膠對照組 10 0.39 2.191±0.595 1.015±0.286***海王鹿皮膠組 10 1.04 2.272±0.493 0.865±0.296***海王鹿皮膠組 10 0.52 1.823±0.387 0.574±0.372海王鹿皮膠組 10 0.26 1.771±0.371 0.311±0.162

3.3 海王鹿皮膠對免疫低下小鼠血清溶血素的影響表3結果表明:與正常對照組比較，模型對照組小鼠的半數溶血值顯著降低，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義，說明免疫低下小鼠模型復制成功。與模型對照組比較，海王鹿皮膠高劑量組、海王鹿皮膠中劑量組的半數溶血值明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義；阿膠對照組的半數溶血值明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義。阿膠對照組和海王鹿皮膠高劑量組的半數溶血值比較，P＞0.05，差異無統計學意義。

表3 海王鹿皮膠對免疫低下小鼠血清溶血素的影響

3 討 論

鹿產業是吉林省重要優勢產業，發展潛力大、后勁足，鹿皮膠保健食品的開發將有利于帶動我省鹿業產品又快又好的提升。由于傳統驢皮膠(阿膠)具有補血、止血、抗氧化、抗休克的作用，尤其是在機體免疫功能的調節方面得到廣泛的證實。人們也日益重視鹿皮膠能否在增強機體免疫力方面發揮與驢皮膠同樣的功效，為此，深入研究鹿皮膠與驢皮膠在增強機體免疫力方面的作用差異，為鹿皮膠保健食品的開發提供理論支持。本組試驗研究表明，與模型對照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的廓清指數K值明顯升高，P＜0.05，差異具有統計學意義；海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義；海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統計學意義。說明海王鹿皮膠與阿膠在提高免疫功能方面作用相當。綜上所述，海王鹿皮膠可明顯增強免疫功能低下小鼠的免疫功能，值得進一步開發利用。