野牦牛及青海地方牦牛品種全線粒體基因組母系遺傳多樣性、分化及系統發育分析

李廣禎，馬志杰*，陳生梅，雷初朝，李瑞哲，謝銀祿，晁生玉

(1.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016；2.青海省高原家畜遺傳資源保護與創新利用重點實驗室，西寧 810016；3.西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；4.青海省格爾木市畜牧獸醫站，格爾木 816000；5.青海省海西州農業技術推廣服務中心，德令哈 817099)

牦牛()是青藏高原及其毗鄰高地十分重要的種質資源，為高海拔游牧民族提供主要的生產、生活資料和經濟支撐。當前，國家畜禽遺傳資源委員會認定的我國牦牛品種(遺傳資源)有20個，其中地方品種(遺傳資源)18個，培育品種2個。青海省地處“世界屋脊”青藏高原東北部，牦牛遺傳資源十分豐富，擁有牦牛500多萬頭，包括4個地方品種(即青海高原牦牛、環湖牦牛、雪多牦牛和玉樹牦牛)、2個培育品種(即大通牦牛和阿什旦牦牛)和少量的野牦牛。線粒體基因組(mitochondrial genome，mitogenome)是一種環狀DNA分子，進化速率快、母系遺傳、不易發生重組且多態性豐富，故被認為是開展動物母系遺傳多樣性、群體遺傳結構及分類等研究的理想工具。牦牛線粒體基因組群體遺傳研究將為更準確地揭示各品種(群體)的母系遺傳多樣性水平、群體結構組成及遺傳關系等問題提供重要信息，為后續有效開展其遺傳資源的保護和選育實踐提供理論基礎。當前，研究者已基于Y-SNP和Y-STR分子標記對青海的9個牦牛品種(群體)以及野牦牛的父系遺傳多樣性、群體遺傳結構及系統發育關系等進行了較為系統的分析，表明青海牦牛父系遺傳多樣性豐富，由2個父系支系組成。然而，在母系遺傳研究方面，雖然先前基于mtDNA D-loop區和等基因核苷酸序列變異對野牦牛及青海地方牦牛品種的研究較多，但基于線粒體基因組全序列變異的研究相對較少。在野牦牛和青海牦牛線粒體基因組研究方面，Wang等對包括21頭青海牦牛(即大通、環湖、青海高原和玉樹牦牛)在內的51頭家牦牛和21頭野牦牛線粒體基因組序列進行綜合分析，表明野牦牛的母系遺傳多樣性高于家牦牛，牦牛由3個高度分化的遺傳分支組成，其中2大分支包含野牦牛和家牦牛的單倍型，其余1個分支僅含有野牦牛的單倍型。最近，Wang等對青海省4個牦牛品種(群體)(即雪多、環湖、祁連和玉樹牦牛)共86頭個體線粒體基因組進行了測定并對其遺傳多樣性及系統發育進行了分析，表明雪多牦牛的單倍型多樣度最高(0.992±0.015)，而環湖牦牛的單倍型多樣度最低(0.905±0.048)；揭示牦牛由3個不同的母系支系組成，且發現雪多牦牛和野牦牛少量個體共存于第3個母系分支。

綜上所述，研究者已利用Y染色體分子標記較為系統地開展了野牦牛及青海地方牦牛品種(群體)的父系遺傳研究。但在其母系遺傳研究中，盡管當前已有少量基于線粒體基因組全序列變異對野牦牛及青海部分牦牛品種(群體)的報道，但其所分析的各品種個體數量較少、采樣點分布不多且缺乏系統性比較研究。此外，青海部分地方牦牛品種(如青海高原牦牛和玉樹牦牛)的分布區與野牦牛生存地毗鄰，存在家、野牦牛竄群現象，故探究各地方牦牛品種與野牦牛之間的關系也顯得尤為重要。然而，已有研究均未能系統深入地反映野牦牛及青海各地方牦牛品種間的母系遺傳多樣性差異、分化狀況、遺傳關系等問題。鑒于此，本研究對野牦牛及青海4個地方牦牛品種進行線粒體基因組全序列比較和系統分析，探究其母系遺傳多樣性水平、分化狀況、聚類關系及系統發育情況，為深入了解野牦牛及青海地方牦牛品種遺傳資源狀況及彼此之間的遺傳關系提供基礎材料，并為后續開展保種和選育研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、基因組DNA提取和序列數據收集

在青海省格爾木市、共和縣、同德縣、河南縣和曲麻萊縣采集青海高原牦牛、環湖牦牛、雪多牦牛、玉樹牦牛頸靜脈血樣3、10、5和4份(表1)，共計22份血樣經ACD抗凝后放入帶有冰袋的保溫箱中帶回實驗室，-80 ℃保存備用。采樣前詢問牧戶有關牦牛群的選育歷史背景信息并查閱系譜記錄情況，確保樣品間無親緣關系且具有代表性。采用血液 DNA 提取試劑盒(北京艾萊德生物科技有限公司)提取基因組 DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測基因組DNA的濃度與純度，當樣品的質量控制參數大于100 ng·μL，OD/OD比值為1.7～1.9時，表明DNA的質量較高，可用于后續基因組重測序。此外，本研究從GenBank中下載已報道的所有野牦牛和青海省4個地方牦牛品種線粒體基因組序列共142條，結合本試驗中測定的22條青海牦牛線粒體基因組序列，對共計164條野牦牛和青海地方牦牛品種線粒體基因組序列進行數據綜合分析(表1)。

表1 野牦牛及青海地方牦牛品種線粒體基因組序列信息來源

1.2 試驗主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 DL2000 DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix、10×Loading Buffer、核酸染料和50×TAE電泳緩沖液均購自上海寶生物工程有限公司。

1.2.2 主要儀器 迷你離心機(Super Mini Dancer)購自上海生工生物工程股份有限公司；0～2.5、0.5～10、10～100、20～200和100～1 000 μL微量移液器和PCR儀(P70)購于德國Eppendorf公司；電泳儀(DYY-12)購于北京六一儀器廠；超凈工作臺(PCR3A-1)購于上海藝斯高貿易有限公司；超純水儀(密理博)購于德國默克公司；-80 ℃超低溫冰柜(8525)購于美國Forma Scintific公司；凝膠成像分析系統(6300)購于上海天能儀器公司；渦旋混合器(WH-861)購于太倉華利達實驗設備有限公司；電子天平(AB204-E)購于梅特勒-托利多集團；高壓蒸氣自動滅菌鍋(LDZ-30KBS)購于上海申安公司；大數據計算機數據處理平臺來源于西北農林科技大學的High-Performance Computing(HPC)。

1.3 牦?；蚪M重測序及全基因組序列的組裝獲取

將22頭青海地方牦牛品種個體的基因組DNA送往北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組重測序，基于Illunina NOVA 6 000測序平臺進行雙末端建庫，reads的長度為2×150 bp。將原始測序數據Raw reads用Trimmomatic v0.36軟件進行質檢，去除低質量序列片段和接頭序列，獲得牦牛各個體的基因組clean reads。具體流程為：1)修剪掉序列雙端質量得分小于20的堿基和N堿基(Leading:20、Trailing:20)；2)自5′端以3 bp滑動窗口進行檢測，平均質量值小于15的進行截斷(Slidingwindow:3∶15)；3)去除平均堿基質量值低于20的序列片段(Avgqual:20)；4)去除修剪后長度小于35 bp的序列片段(Minlen:35)；5)堿基質量值體系設置為 phred-33(Tophred 33)。使用BWA-MEM v0.7.15軟件將質控后的clean reads比對到牦牛的參考基因組(序列號: VBZB00000000, BosGru3.0)上，組裝成完整的牦?；蚪M序列。分別使用samtools v0.1.19和picard v2.5.0軟件進行bam文件排序和序列PCR去重，用qualimap軟件統計所有樣本的測序深度。

1.4 牦牛線粒體基因組全序列的提取

為了提高獲取的線粒體基因組序列完整性，將參考線粒體基因組(登錄號：NC_006380)首端和末端各添加可識別的30 bp序列，先使用Burrows-Wheeler Aligner v0.7.15軟件將本研究中的22條牦牛全基因組序列與參考線粒體基因組序列進行比對，再使用samtools v0.1.19 軟件將比對結果轉換為BAM文件，后使用基因組分析工具包GATK v3.8進行插入或缺失重新排列(InDel重組)，以確定獲得完整的線粒體基因組序列。

1.5 數據分析

用BioEdit 7.2.5軟件進行牦牛全線粒體基因組序列的多序列比對分析，統計序列長度和多態位點?；贒nasp5.10和Arlequin3.11軟件分析確定各品種(群體)的單倍型及單倍型組數目和類型，計算單倍型多樣度(haplotype diversity, Hd±SD)和核苷酸多樣度(nucleotide diversity, π±SD)大小，取10 000次重復在5%的水平上確定其差異顯著情況，以探究各牦牛品種(群體)的遺傳多樣性水平及其差異。品種(群體)間的固定分化指數(fixation index,)也通過Arlequin3.11軟件計算獲得，以揭示牦牛品種(群體)間的分化狀況。值通過線性化的值計算獲得，即=(1-)。用SPSS18.0軟件基于值進行多維尺度(multidimensional scaling, MDS)分析，以揭示各牦牛品種(群體)間的聚類情況和遺傳關系。用MEGA7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建系統發育樹，并用Network10.1軟件構建網絡中介圖(median-Joining, MJ)以揭示不同單倍型(組)間的系統發育關系。

2 結 果

2.1 5個牦牛品種(群體)線粒體基因組遺傳變異及遺傳多樣性分析

經基因組重測序獲得的22頭青海地方牦牛品種個體的基因組測序深度在22.44X-27.36X之間，平均測序深度為23.94X，平均基因組覆蓋率達98.01%。序列比對分析表明，164條全線粒體基因組序列長度在16 322～16 329 bp之間，排除15處插入或缺失位點后共檢測到322個變異位點，其中單一多態位點148個，簡約信息位點174個(表2)。青海4個地方牦牛品種中共發現變異位點203個，在青海高原、玉樹、環湖和雪多牦牛中分別檢測到152、151、144和138個變異位點，而在野牦牛群體中檢測到247個變異位點。根據線粒體基因組序列間遺傳變異，共確定了115種單倍型，其中H37與H38兩種單倍型為優勢單倍型，均被4個青海地方牦牛品種所共享，所占個體(序列)數分別為10個和19個；有101種單倍型為稀有單倍型，均被不同牦牛品種(群體)的1個個體(序列)所擁有；其余單倍型被不同的牦牛品種(群體)所共享，如單倍型H28被環湖、青海高原、玉樹牦牛所共享，H40被環湖、青海高原牦牛所共享，H56被環湖、玉樹牦牛所共享。在青海高原、環湖、雪多、玉樹和野牦牛品種(群體)中分別確定了30、24、26、26和22種單倍型，其中特異單倍型數依次為26、18、23、19和22種(表2)。各品種(群體)的單倍型組分布情況見表2，可以看出，野牦牛群體的個體(序列)分布在A、B、C、D、E、F、G和H共8種單倍型組中，頻率分別為37.50%(9/24)、20.83%(5/24)、4.17%(1/24)、16.67%(4/24)、8.33%(2/24)、4.17%(1/24)、4.17%(1/24)和4.17%(1/24)，而4個青海地方牦牛品種的個體(序列)分布在A、B、C、D、G和H共6種單倍型組中，所占比列分別為62.14%(87/140)、16.43%(23/140)、7.14%(10/140)、12.86%(18/140)、0.71%(1/140)和0.71%(1/140)，提示E和F兩種單倍型組僅存在于野牦牛群體中。值得注意的是，只有A、B和D三種單倍型組被野牦牛和青海4個地方牦牛品種所共享，所占頻率分別為58.54%(96/164)、17.07%(28/164)和13.41%(22/164)，而C單倍型組被除環湖牦牛外的其他品種(群體)共享，G單倍型組只被雪多牦牛和野牦牛所共享，H單倍型組只被玉樹牦牛和野牦牛所共享。單倍型多樣度和核苷酸多樣度計算結果表明，野牦牛的單倍型多樣度(0.992 8±0.014 4)和核苷酸多樣度(0.003 5±0.001 8)均高于青海4個地方牦牛品種的單倍型多樣度(0.973 1±0.007 7)和核苷酸多樣度(0.002 5±0.001 2)。在4個青海地方牦牛品種中，雪多牦牛的單倍型多樣度最高，為0.988 5±0.012 6；環湖牦牛的單倍型多樣度最低，為0.939 3±0.027 8；而玉樹牦牛與青海高原牦牛的單倍型多樣度值居中，分別為0.975 8±0.018 7和0.973 0±0.016 6。青海高原、環湖、雪多、玉樹牦牛的核苷酸多樣度分別為0.002 9±0.001 4、0.002 1±0.001 0、0.002 1±0.001 1和0.002 7±0.001 4(表2)。

表2 5個牦牛品種(群體)遺傳多樣性指數大小

2.2 5個牦牛品種(群體)間遺傳分化及多維尺度分析

通過計算5個牦牛品種(群體)間的固定分化指數值()大小(表3)，結果表明，野牦牛與青海高原、環湖、雪多、玉樹牦牛間的值分別為0.009 9、0.041 2、0.023 6和-0.008 8；4個青海地方牦牛中，青海高原牦牛與環湖、雪多、玉樹牦牛間的值分別為0.020 0、0.035 8和0.018 7，環湖牦牛與雪多、玉樹牦牛間的值分別為0.011 2和0.033 8，而雪多牦牛和玉樹牦牛之間的值為0.011 3。

表3 5個牦牛品種(群體)間FST值(下三角)和RST值(上三角)

基于各牦牛品種(群體)間的值構建多維尺度(MDS)關系聚類圖(圖1)，結果顯示，4個青海地方牦牛品種各自占據一個象限；在維數1中野牦牛、玉樹牦牛和青海高原牦牛聚為1類，而環湖牦牛和雪多牦牛聚為1類；在維數2中青海高原牦牛與野牦牛、玉樹牦牛再次被分開，而環湖牦牛與雪多牦牛被再次分開。

圖1 基于MDS分析構建的5個牦牛品種(群體)間聚類關系

2.3 牦牛品種(群體)線粒體基因組系統發育分析

對5個牦牛品種(群體)線粒體基因組單倍型構建系統發育樹(圖2)，結果表明，115種單倍型分布在A、B、C、D、E、F、G和H共8種單倍型組中，分別占58.54%、17.07%、6.71%、13.41%、1.22%、0.61%、1.22%和1.22%。8種單倍型組組成了明顯的3個母系遺傳分支(即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ)，其中Mt-Ⅰ支系由包含83種單倍型的A、B、E和F 共4種單倍型組構成，所占比例為72.17%(83/115)，由127個個體(序列)分享。Mt-Ⅱ支系包含30種單倍型，占26.09%(30/115)，分屬C、D和H 3種單倍型組，由35個個體(序列)分享。值得注意的是，共有2種單倍型分布在Mt-Ⅲ支系中，包括雪多牦牛和野牦牛各1個個體(序列)，所占比例僅為1.74%(2/115)。

a.NJ法構建的系統發育圖；b.MJ法構建的Network圖

3 討 論

遺傳多樣性是衡量一定區域范圍內動物遺傳資源豐富程度的重要指標之一，其對動物遺傳資源的保護和育種策略的制定都具有重要指導意義。在本研究中，發現5個牦牛品種(群體)均擁有其特有的單倍型，如野牦牛中確定特有單倍型22種，青海高原、環湖、雪多、玉樹牦牛中各確定26、18、23和19種特有單倍型，這說明野牦牛及青海省4個地方牦牛品種均擁有特有的母系遺傳信息。本研究母系遺傳多樣性分析表明，野牦牛線粒體基因組單倍型多樣度為0.992 8±0.014 4，高于4個青海地方牦牛品種的單倍型多樣度(0.973 1±0.007 7)，表明野牦牛具有更豐富的母系遺傳多樣性，其多樣性水平高于家牦牛，這與Wang等基于51條家牦牛和21條野牦牛線粒體基因組序列對家、野牦牛母系遺傳多樣性的研究結果吻合，也與先前基于mtDNA D-loop區、基因序列對家、野牦牛遺傳多樣性的研究結果一致。而在青海4個地方牦牛品種中，本研究結果表明雪多牦牛的單倍型多樣度最高(0.988 5±0.012 6)，玉樹牦牛與青海高原牦牛的單倍型多樣度值居中(即(0.975 8±0.018 7)和(0.973 0±0.016 6))，而環湖牦牛的單倍型多樣度最低(0.939 3±0.027 8)，說明雪多牦牛的母系遺傳多樣性在4個地方牦牛品種中最高，而環湖牦牛的遺傳多樣性水平最低，這與Wang等基于86條線粒體基因組序列對青海省4個牦牛品種(群體)(即雪多、環湖、祁連和玉樹牦牛)的遺傳多樣性研究結果基本吻合?？傮w來看，本研究中4個青海地方牦牛品種的母系遺傳多樣性均較高，遺傳變異豐富，但相比而言，青海高原、玉樹和雪多牦牛的母系遺傳多樣性水平相差不大，均稍高于環湖牦牛的遺傳多樣性。究其原因，可能與各地方牦牛品種不同的近交程度、受選擇強度及群體結構組成等因素相關。

固定分化指數()值為動物群體間遺傳分化指數大小，可以評估不同群體間的遺傳分化程度。Wright研究表明，值在0～0.05之間說明群體間遺傳分化程度很弱；在0.05～0.15之間說明群體間達到中等遺傳分化；在0.15～0.25之間說明群體間遺傳分化大；大于0.25時則說明群體間分化程度極大。當前，尚未見有關野牦牛及青海4個地方牦牛品種間母系遺傳分化狀況的研究報道。在本研究中，野牦牛與4個青海地方牦牛品種間的值在-0.008 8～0.041 2之間，而4個青海地方牦牛品種間的值在0.011 2～0.035 8之間，說明4個青海地方牦牛品種間及各品種與野牦牛群體間的值均在0～0.05之間，表明青海各地方牦牛品種間以及與野牦牛群體間的遺傳分化均很小，分化程度很弱，該結果與馬志杰對青海地方牦牛品種及野牦牛父系遺傳分化的研究結果一致，說明4個青海地方牦牛品種間及與野牦牛群體之間遺傳分化均較小。本研究結果表明，雪多牦牛與青海高原牦牛間值最大(0.035 8)，而與環湖牦間值最小，為0.011 2，提示雪多牦牛與青海高原牦牛間分化程度最大，而與環湖牦牛分化程度最小?？傮w來看，各牦牛品種(群體)間值大小存在差異，其值大小一定程度上反映了它們之間分化程度的情況。此外，本研究各牦牛品種(群體)間多維尺度(MDS)聚類關系分析顯示，4個青海地方牦牛品種(即青海高原、環湖、雪多和玉樹牦牛)各自占據一個象限，分別獨立為1類，表明青海各地方牦牛品種間存在明顯的母系遺傳差異?？傮w來看，玉樹牦牛與野牦牛聚類更近，表明它們之間遺傳關系也較近且擁有更多相似的母系遺傳成分，而環湖牦牛和雪多牦牛聚類較近，青海高原牦牛和玉樹牦牛聚類較近，均一定程度上反映了它們彼此之間母系遺傳關系的遠近程度，這種品種(群體)間的聚類結果和遺傳關系，與各品種(群體)間的分化程度、地理分布遠近基本一致。

牦牛的起源和系統發育研究有助于揭示其遺傳背景、進化歷史和系統發育關系。在先前的研究報道中，基于mtDNA D-loop區、-和等基因序列片段核苷酸變異對家、野牦牛母系系統發育的研究相對較多，而利用線粒體基因組全序列變異對牦牛母系遺傳支系的組成及起源研究相對較少。在本研究中，基于線粒體基因組全序列變異對野牦牛及青海4個地方牦牛品種進行了系統發育分析，研究表明所確定的115種家、野牦牛單倍型可明顯的聚為3個母系遺傳分支，即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ，所占比例分別為72.17%、26.09%和1.74%，且3個母系分支中均有家、野牦牛個體分布，這與Wang等、Wang等、Ma等基于線粒體全基因組變異對野牦牛及其他家牦牛品種(群體)的研究結果基本一致，說明牦牛由3個母系支系組成，以Mt-Ⅰ支系為主，推測可能有3個母系起源。

4 結 論

本研究結果表明，青海4個地方牦牛品種和野牦牛群體均具有豐富的母系遺傳多樣性；各品種(群體)擁有特有的母系遺傳信息，存在一定的母系遺傳差異，但彼此間遺傳分化程度很弱；玉樹牦牛與野牦牛親緣關系最近，4個地方牦牛品種中雪多牦牛與環湖牦牛親緣關系最近；野牦牛和青海家牦牛品種由3個母系支系組成，推測牦牛有3個母系起源。