原兒茶酸對副溶血弧菌的抑菌和減毒作用

蘆平，劉歡，肖苗，李瑩玉，趙燕妮

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）

副溶血弧菌是具有兩套鞭毛系統的弧狀革蘭氏陰性病原菌，在自然環境中廣泛分布于河流與?？?，為魚、蝦的主要致病菌[1]。人如果誤食受副溶血弧菌污染的產品，會出現腹痛、腹瀉等癥狀，嚴重時可導致急性胃腸炎和敗血癥，引起感染者休克甚至死亡。近年來，由副溶血弧菌引起的相關病例報導激增，表明副溶血弧菌已成為一種重要的食源性致病菌。研究發現，副溶血弧菌具有胞外多糖、胞外蛋白酶、生物被膜、溶血毒素等多種毒力因子，這些毒力因子對副溶血弧菌在宿主體內的定殖和病害的發生發揮著重要作用[2-4]。

食物腐敗現象普遍存在，食源性病原菌引起的食物中毒嚴重威脅人類健康，抑制腐敗微生物的生長以減少食品安全問題的發生顯得格外重要。防腐劑廣泛應用于食品保鮮，按來源可分為天然食品防腐劑和化學合成防腐劑，化學合成防腐劑因易累積、難代謝而具有潛在危害性，因此，來源安全的天然防腐劑更受消費者的關注和認可。植物多酚富含于許多草本植物中，展現出良好的抑菌活性，且具有抗腫瘤、防衰老、降血壓血脂等多種保健功能，在食品、生物與醫藥行業具有廣闊的應用前景[5,6]。原兒茶酸是植物體內重要的酚酸，廣泛存在于茶葉、蔬菜和水果中，也是烏蕨、大血藤等中草藥的有效成分[7,8]。據報道，原兒茶酸具有抑菌[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11,12]的效果。

本實驗選取海產品中常見的副溶血弧菌作為供試菌，探究原兒茶酸對副溶血弧菌的抑制作用，通過測定原兒茶酸對副溶血弧菌的最小抑菌濃度、胞內核酸和蛋白泄漏量、丙二醛（MDA）含量，同時通過掃描電鏡觀察細胞表面形態變化來評估原兒茶酸對副溶血弧菌細胞膜的損傷作用。此外，選取1/4 MIC和1/2 MIC作為亞抑菌濃度，探究低濃度原兒茶酸對副溶血弧菌毒力的衰減作用，為原兒茶酸在食品防腐中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

原兒茶酸（≥97%，色譜純），上海源葉生物科技有限公司；NaCl（≥99%，分析純），天津天力化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國Oxoid集團；天藍色皮粉，美國Sigma公司；瓊脂粉，上海生工股份有限公司；丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物研究所；其他所用試劑均為市售分析純。

恒溫搖床，江蘇同君儀器科技有限公司；電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo集團；高速離心機、多功能酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific集團；超微量分光光度計，美國Quawell公司。

1.2 菌株和培養基

副溶血弧菌（RIMD 2210633）由陜西科技大學食品與生物工程學院微生物實驗室提供；細菌基礎培養基（Luria-Bertani broth，LB）（g/L）：蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，氯化鈉10.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將凍存在-80 ℃的菌種劃線至LB平板上培養，然后挑取單菌落接種到含有5 mL LB液體培養基的培養瓶中，于37 ℃恒溫搖床中以轉速200 r/min過夜培養，調整細菌培養液OD600為1.0（約5.0×106CFU/mL），以供后續使用。

1.3.2 最小抑菌濃度（MIC）測定、亞抑制濃度（SICs）選擇和抑菌圈實驗

采用二倍稀釋法[13]測定原兒茶酸對副溶血弧菌的最小抑菌濃度，MIC定義為完全抑制副溶血弧菌生長的最低原兒茶酸濃度，并選擇1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC三個濃度作為原兒茶酸的SICs用于后續實驗。根據周芳等[14]的方法，采用牛津杯法測定不同濃度原兒茶酸對副溶血性弧菌的抑菌活性。在培養皿中放置4個已滅菌的牛津杯，LB固體培養基滅菌后倒平板，培養基凝固后吸取100 μL菌懸液菌液涂布在平板上，風干后取出牛津杯，然后吸取200 μL不同濃度的原兒茶酸溶液分別加入到孔中。將培養皿于37 ℃恒溫培養箱正置培養24 h，以不加原兒茶酸為對照，測量抑菌圈直徑大小。

1.3.3 生長曲線測定

吸取50 μL活化的細菌培養液，加入至5 mL含有不同濃度（0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL）原兒茶酸的LB液體培養基中，輕微振蕩，置于恒溫搖床中37 ℃以轉速200 r/min進行培養。每隔1 h吸取200 μL培養液，以LB液體培養基作為空白對照，測定OD600值，并繪制生長曲線。

1.3.4 核酸和蛋白質含量測定

根據Zhou等[15]的方法進行修改，測定泄漏的核酸、蛋白質含量。吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養基中，37 ℃培養6 h后加入原兒茶酸進行處理，孵育3 h后在4 ℃以10000 r/min轉速離心1 min，使用超微量分光光度計分別測定上清液核酸和蛋白質的含量。

1.3.5 丙二醛（MDA）含量測定

吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養基中，37 ℃培養6 h后加入原兒茶酸，處理3 h后，按照細胞丙二醛測定試劑盒說明書要求，對樣品中的MDA含量進行測定。

1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Giuliano[16]的實驗方法加以修改，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養基中，37 ℃培養6 h后加入原兒茶酸，處理3 h后離心吸取800 μL上清液甲醇氯仿以提取蛋白。離心棄去上清液，加入20 μL上樣緩沖液并沸水浴5 min，根據電泳樣品制備步驟進行蛋白電泳。

1.3.7 場發射掃描電鏡觀察

場發射掃描電鏡對副溶血弧菌形態的觀察參照Shi等[17]的方法，具體步驟如下：吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養基中，于37 ℃培養6 h后加入不同濃度原兒茶酸處理4 h。離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌后重懸在2.5%（V/V）的戊二醛水溶液中固定，于4 ℃靜置過夜。隨后，用不同濃度的乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，V/V）進行梯度脫水處理，每次脫水時間為10 min，將樣品于70 ℃烘干3～4 h至干燥，并裝載在載物臺，噴金后使用場發射掃描電鏡進行觀察。

1.3.8 胞外多糖含量測定

于培養瓶中加入5 mL LB液體培養基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻后于37 ℃恒溫搖床培養9 h。吸取1.5 mL菌液，以12000 r/min轉速離心1 min，取1 mL上清液加入3倍體積的95%乙醇并于4 ℃靜置過夜，以4000 r/min轉速離心15 min，測定沉淀物中胞外多糖的含量。

1.3.9 胞外蛋白酶含量測定

于培養瓶中加入5 mL LB液體培養基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻，置于恒溫搖床上37 ℃培養9 h，測定在600 nm處的吸光度，記為OD1。吸取1.5 mL菌液，以10000 r/min轉速離心1 min，吸取1 mL上清加入新的培養瓶中，然后再加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）和0.01 g天藍色皮粉（Hide Powder Azure，HPA，Sigma-Aldrich），于37 ℃恒溫搖床培養2 h，以轉速12000 r/min離心1 min，取上清液于600 nm處測量吸光度，記為OD2，分別計算OD2與OD1的比值并進行作圖。

1.3.10 生物被膜含量測定

于培養瓶中加入5 mL LB液體培養基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻后于37 ℃培養48 h以形成生物被膜。小心倒去培養液，加入1 mL質量分數為2%（m/V）的結晶紫染色1 min，洗去多余染液后晾干，再加入1 mL質量分數為33%（V/V）的冰乙酸溶解生物被膜，并測定其在570 nm處的吸光度。

1.4 數據處理和分析

所有實驗均至少重復三次，并使用GraphPad Prism 7.00軟件進行數據處理和分析。當p<0.05時表示顯著（圖中以*表示），p<0.01時表示極顯著（圖中以**表示），統計學差異采用單因素方差分析（ANOVA）確定。

2 結果與討論

2.1 原兒茶酸抑菌活性分析

2.1.1 原兒茶酸的MIC及敏感性分析

當原兒茶酸的濃度低于2 mg/mL時，副溶血弧菌經過24 h的培養均進行了不同程度的增殖，培養液出現渾濁；當原兒茶酸的濃度達到或高于2 mg/mL時，副溶血弧菌經過24 h的培養沒有肉眼可見的細菌生長，培養液澄清透亮，與未接種細菌的空白組基本相同?？梢?，原兒茶酸對副溶血弧菌的MIC為2 mg/mL。從圖1可知，當原兒茶酸濃度為1/4 MIC時，與對照組相比無明顯變化；當原兒茶酸濃度為1/2 MIC時，加樣孔周圍細菌生長減少；當原兒茶酸濃度達到MIC時，抑菌圈直徑為18.37 mm，此時加樣孔周圍未見細菌生長。原兒茶酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌的MIC分別為3.0、0.9、1.25 mg/mL[18,19]，對阪崎腸桿菌ATCC29544、ATCC29004、ATCC12868、12-2的MIC分別為5、5、5和2.5 mg/mL[9]?？梢?，原兒茶酸對革蘭氏陰性菌和陽性菌都具有抑菌作用，但對于不同菌種或同一菌種不同菌株的抑菌活性不盡相同。

2.1.2 原兒茶酸對副溶血弧菌生長的影響

從圖2可以看出，對照組中副溶血弧菌迅速進入對數生長期，培養至8 h后即進入穩定期，生長趨緩；培養12 h后OD600值為1.06。原兒茶酸的濃度大于或等于2 mg/mL時，副溶血弧菌在整個檢測周期中未見增殖。當原兒茶酸的濃度達到1 mg/mL時，副溶血弧菌進入對數生長期的時間明顯滯后，在整個生長周期中的菌體濃度均低于對照組，9 h后進入穩定期，培養12 h后OD600為0.86；當原兒茶酸濃度為0.5、0.25、0.125 mg/mL時，培養物OD600分別為0.99、0.96、0.99，與對照組相比不存在顯著差異。進一步證明原兒茶酸對副溶血弧菌的MIC為2 mg/mL。

2.2 原兒茶酸對副溶血弧菌細胞膜的影響

2.2.1 原兒茶酸對核酸、蛋白質泄漏的影響

細胞膜參與細菌的能量轉換、信號傳遞和物質運輸[20]，并能有效防止核酸、蛋白質等生物大分子從胞內泄漏至胞外。從圖3a可知，沒有添加原兒茶酸的副溶血弧菌在培養3 h后的胞外核酸量與0 h基本相同，而經不同濃度原兒茶酸處理的副溶血弧菌胞外核酸量則顯著上升，且隨著濃度的增加而增高，在經過MIC濃度的原兒茶酸處理3 h后，細菌培養液上清中的核酸含量達到2187.28 ng/mL，為對照組的2.65倍。同樣地，原兒茶酸處理后副溶血弧菌胞外總蛋白的含量隨其添加量的增加而升高，當用MIC濃度原兒茶酸處理3 h后，胞外總蛋白含量達到34.28 mg/mL，為對照組的1.94倍（圖3b）。此外，利用SDS-PAGE對不同濃度原兒茶酸處理后的細菌胞外總蛋白進行了分析，結果如圖3c所示，處理組和對照組均出現明顯的條帶，與對照組相比，當原兒茶酸濃度增大時，分子量在10、25、33、40 ku附近的蛋白質條帶變化不明顯，說明原兒茶酸對小分子量蛋白質泄漏的影響不大，但當原兒茶酸的濃度增加到1/2 MIC和MIC時，蛋白條帶顏色加深，尤其是分子量在95～180 ku范圍附近的條帶，表明大分子量的蛋白質發生了明顯的泄漏。出現這一現象的原因可能是具有選擇透過性的細胞膜在原兒茶酸作用后發生了破損，失去了原有的選擇透過性，使得除了菌體正常外泌的蛋白外，胞內的大量蛋白外泄。賈振宇等[9]報道原兒茶酸可降低阪崎腸桿菌細胞膜的完整性和通透性，從而起抑制其生長。朱金帥等[19]發現MIC濃度下的沒食子酸可以顯著提高腐敗希瓦氏菌胞外核酸和總蛋白的含量。

2.2.2 原兒茶酸對丙二醛含量的影響

丙二醛是細胞膜脂質代謝的特征終產物之一，可作為脂質過氧化評價的重要參考指標。如圖4所示，沒有添加原兒茶酸的副溶血弧菌在培養3 h后的丙二醛含量較0 h略有上升，在經1/4 MIC原兒茶酸處理后，丙二醛的含量為對照組的1.59倍；而經不同濃度原兒茶酸處理的副溶血弧菌胞外核酸量則顯著上升，且隨著濃度的增加而增高，當濃度達到1/2 MIC時，副溶血弧菌培養液上清中的丙二醛含量顯著上升，為對照組的3.80倍；在原兒茶酸濃度達到MIC時，丙二醛含量達到1.40 nmol/mL，為對照組丙二醛含量的10.05倍。原兒茶酸能夠攻擊細胞膜上游離的自由電子，破壞氧自由基反應的動態平衡，誘導活性氧（ROS）產生，形成氧自由基連鎖反應，導致脂質過氧化，產生過量丙二醛[21]?？梢?，原兒茶酸可引起副溶血弧菌細胞膜的氧化損傷，且損傷程度隨著原兒茶酸濃度的增加而增強。

2.2.3 原兒茶酸對副溶血弧菌形態的影響

如圖5所示，未經原兒茶酸處理的副溶血弧菌形態飽滿，表面光滑。經1/4 MIC濃度的原兒茶酸處理后副溶血弧菌菌體未見明顯變化，依舊能維持正常形態。經1/2 MIC濃度的原兒茶酸濃度處理后，部分菌體開始發生皺縮，表面變得粗糙。在MIC濃度原兒茶酸處理后，副溶血弧菌出現集聚，菌體發生嚴重內陷，已不能維持細菌正常的形態。在2 MIC濃度原兒茶酸處理后，副溶血弧菌嚴重干癟并且發生破裂，失去原本的形態，可見原兒茶酸主要通過影響細胞膜的完整性破壞副溶血弧菌的正常細菌形態。

目前，植物多酚的抑菌機制主要有：一是破壞細胞壁的完整性和細胞膜的通透性，影響細胞的正常形態；二是通過去極化或超極化方式，影響細胞膜電位；三是影響細菌的能量代謝；四是抑制生物大分子的合成[22]。然而，由于植物多酚成分復雜且受試菌不盡相同，我們難以從某一方面深入闡明植物多酚的抑菌機理。本實驗發現，原兒茶酸能夠使細胞壁凹陷、坍塌，影響細胞膜的完整性和通透性，進而破壞細胞的正常形態，導致核酸、蛋白質等生物大分子的泄漏。此外，已有研究發現，原兒茶酸能直接作用于DNA，抑制基因的轉錄和蛋白質的翻譯，干擾核酸和蛋白質正常代謝[23,24]，但原兒茶酸是否會對副溶血弧菌基因表達和蛋白質合成產生影響，還需要進一步驗證。

2.3 原兒茶酸對副溶血弧菌毒力衰減作用

2.3.1 原兒茶酸對副溶血弧菌胞外多糖合成的影響

胞外多糖是細菌生物被膜的重要組分，與細菌毒力密切相關。從圖6可以看出，副溶血弧菌胞外多糖產量隨著原兒茶酸濃度的增加而減少。當原兒茶酸濃度分別達到1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時，其對胞外多糖產量的抑制率分別為22.30%、40.57%和52.85%，與對照組相比，均存在顯著差異性，說明原兒茶酸能夠降低副溶血弧菌胞外多糖的含量。本實驗室前期研究發現，植物精油（如檸檬醛）通過抑制相關調控基因VPA1406的表達降低副溶血弧菌胞外多糖的合成，在檸檬醛濃度為1/2 MIC時VPA1406的表達下調了7.80倍[25]。

2.3.2 原兒茶酸對副溶血弧菌胞外蛋白酶的影響

堿性絲氨酸蛋白酶是副溶血弧菌胞外蛋白酶的主要成分，也是副溶血弧菌在感染、侵襲宿主過程中發揮重要作用的外毒素之一。由圖7可知，在沒有添加原兒茶酸的對照組中，上清液與底物反應后形成明顯的藍色，即副溶血弧菌可產生大量的胞外堿性絲氨酸蛋白酶。當原兒茶酸濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時，對胞外蛋白酶的抑制率分別為14.85%、19.79%和28.38%，與對照組相比均存在顯著性差異。實驗室前期研究發現香草酸可通過抑制群體感應中樞元件LuxR的表達而抑制堿性絲氨酸蛋白酶合成[26]。副溶血弧菌胞外蛋白酶以及其他毒力因子受到群體感應系統的緊密調控，而許多植物提取物中的酚類物質都證明具有抑制群體感應系統的作用，如干擾信號分子的合成或抑制群體感應元件的表達[27]。后期可深入研究原兒茶酸對副溶血弧菌群體感應系統的作用。

2.3.3 原兒茶酸對副溶血弧菌生物被膜形成的影響

生物被膜是由細菌及其分泌的胞外多糖、蛋白、核酸等共同組成的具有一定三維結構的復合物，有助于包裹在其中的細菌抵抗抑菌劑的抑制作用，提高細菌的環境耐受性[28]。由圖8可知，在沒有添加原兒茶酸的對照組中，副溶血弧菌可以形成一圈明顯的生物被膜，而在添加了原兒茶酸后，其被膜量明顯減少。當原兒茶酸濃度為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時，其對副溶血弧菌生物被膜的抑制率分別為22.37%、26.04%和34.69%，與對照組相比均存在顯著性差異?？梢?，原兒茶酸對副溶血弧菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，且隨濃度的增加而增強。生物被膜的形成一般需要經過5個階段：第一階段是微生物在基質表面建立可逆的吸附作用；第二階段是微生物分泌聚合物使其牢固黏附于基質表面；第三階段是細菌在基質表面生長，形成不成熟的被膜；第四階段是細菌持續生長形成具有穩定結構的成熟生物被膜；第五階段是三維結構發生改變，沿四周不斷延展形成新的生物被膜[29]。Bernal-Mercado等[30]報道兒茶素、原兒茶酸和香草酸的混合物可以有效地阻止大腸桿菌細胞在基質表面的吸附，清除不成熟的被膜。原兒茶酸對副溶血弧菌生物被膜的抑制作用主要在哪個階段進行以及對成熟的生物被膜是否具有清除作用尚不明確，也未見相關文獻報導，后續可以考慮設計相關實驗進行更為深入的探究。

3 結論

原兒茶酸對副溶血弧菌具有一定的抑菌活性和減毒作用，其最小抑菌濃度為2 mg/mL，且主要作用于細胞膜。原兒茶酸能促使細胞膜發生凹陷、坍塌，影響細胞膜的完整性和通透性，導致核酸、蛋白質泄漏至胞外，破壞細胞正常形態，并引起脂質過氧化，使細菌的生長繁殖受阻，最終導致其凋亡。在亞抑菌濃度下，原兒茶酸能明顯抑制副溶血弧菌胞外多糖、胞外蛋白酶和生物被膜的合成，具有良好的毒力衰減作用。